肝细胞铁死亡在肝脏相关疾病的研究进展

吴姜杰 齐家龙 宋正己

肝病是全球疾病负担及死亡相关病因的主要原因之一[1]。在中国,病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病及与之相关的肝硬化、肝癌等各类肝病约有3亿人受累[2]。因此,探究肝病的发病机制具有重要的临床意义和社会价值。

细胞死亡基于功能方面的差异可分为两种类型,即意外细胞死亡(accidental cell death,ACD)和调节细胞死亡(regulated cell death,RCD)。随着细胞检测技术的发展,不同种类的RCD及其核心通路被解析。2012年,Dixon等发现Erastin的抗癌活性依赖于诱导一种新型调节性细胞死亡方式,后来被命名为铁死亡。铁死亡是铁依赖活性的RCD,其与经典的细胞凋亡、细胞自噬及细胞坏死具有明显的差异。在形态学上,铁死亡表现为线粒体变小、外膜破裂、嵴减少或消失;从生物化学的角度来看,铁死亡是通过铁蓄积、过量的活性氧和脂质过氧化来介导的[3]。自从铁死亡这种全新的死亡模式被揭示后,越来越多的证据显示铁死亡在肝病的发生和发展中起着关键作用。

一、铁死亡的核心机制

(一)铁稳态调节及其对铁死亡的影响 铁离子是引发铁死亡途径的触发因素。膳食中的铁从十二指肠绒毛上皮细胞吸收后通过转铁蛋白及转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFR)导入并被分选到内体中,以Fe3+形式由前列腺六跨膜上皮抗原3(six-transmembrane epithelial antigen of the prostate 3,STEAP3)还原为Fe2+,之后通过二价金属转运蛋白1(divalent metal transport 1,DMT1)释放到细胞质,储存在不稳定的铁池或铁蛋白中发挥作用,多余的Fe2+可通过铁转运蛋白排泄到细胞外循环中[4],以上环节共同维持着铁稳态的平衡。当细胞对铁的摄入量增加或铁的输出量减少时,都会使细胞对铁死亡更加敏感。此外,核受体共激活因子4 (nuclear receptor co-activator 4,NCOA4)将铁蛋白转运至溶酶体进行降解[5]。铁蛋白解链后释放的催化铁又使细胞内不稳定铁水平升高,过载的铁与过氧化氢发生芬顿反应,导致羟基自由基和过氧化物的形成及细胞膜磷脂的破坏,这是引发铁死亡的重要机制。

(二)脂代谢及其对铁死亡的影响 脂质过氧化是铁死亡的典型征象,包括两大途径。在非酶促反应中,磷脂中多不饱和脂肪酸(PUFA-PLS)的二烯丙基位置与氢结合,形成以碳为中心的磷脂自由基(PL·),随之又与氧反应形成磷脂过氧化物自由基(PL-OO·),然后从其他多不饱和脂肪酸中获取氢生成脂质过氧化物(PLOOH)和脂质自由基(PL·)[6]。相比之下,酶促反应主要由脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)执行,可催化PUFA的双氧反应以产生各种PLOOH[7]。在此之前,游离多不饱和脂肪酸可以激活酰基辅酶 A 合酶长链家族成员4(acyl-coA synthetase long-chain family member 4,ACSL4)进行酯化,并通过溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶 3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)与膜磷脂结合,ACSL4上调被认为是铁死亡的生物标志物[8]。脂代谢异常最终产生的脂质过氧化物会改变脂质双层的物理性质,同时分解为反应性毒物(如4-羟基-2-壬烯醛和丙二醛),这些醛类可通过交联促进铁死亡[9]。

(三)系统Xc-及其对铁死亡的影响 Xc-转运蛋白系统由调节亚基溶质载体家族3成员2(solute carrier family 3 member 2,SLC3A2)和催化亚基溶质载体家族7成员11(solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)组成,以1∶1的比例从细胞中释放谷氨酸同时摄取胱氨酸。胱氨酸被还原为半胱氨酸,在谷氨酰半胱氨酸合酶/谷胱甘肽合酶的作用下合成谷胱甘肽(glutathione,GSH)[10]。GSH是哺乳动物细胞中最丰富的抗氧化剂,可以降低细胞中活性氧(reactive oxygen species,ROS)的积累。研究发现GSH的缺失会导致谷胱甘肽过氧化物酶失活,随后筛选出谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4),该基因的敲低或过表达可影响Erastin诱导的铁死亡,但对其他形式的细胞死亡没有影响[11]。综上,GPX4利用含有半胱氨酸的谷胱甘肽来消除脂质过氧化物,如果此过程受阻就会引发铁死亡。GPX4是一种硒蛋白,而甲羟戊酸途径的产物异戊烯基焦磷酸盐(isopentenyl pyrophosphate,IPP)是合成硒代半胱氨酸的重要来源[12]。因此,IPP 和甲羟戊酸通路的抑制剂(他汀类药物)也可通过影响 GPX4 来调节铁死亡。

(四)其他通路及其对铁死亡的影响 Bersuker等[13]使用 CRISPR-Cas 9技术发现了一种完全独立于GPX4-GSH-半胱氨酸轴的铁死亡调控系统,当过表达线粒体凋亡诱导因子-2(AIFM2)时,可弥补GPX4缺失的影响。由于AIFM2在铁死亡中发挥的作用,它被重新命名为铁死亡抑制蛋白-1(ferroptosis-suppressor-protein 1,FSP1),其机制是通过NADPH将辅酶Q10(coenzyme Q10,CoQ10)还原为泛素醇,泛素醇再捕获脂质过氧化物。Kraft等[14]通过全基因组筛选证实GTP水解酶1(GTP cyclohydrolase 1,GCH1)产生的代谢物四氢生物蝶呤(tetrahydrobiopterin,BH4)可生成还原性CoQ10,并且作为内源性自由基捕获抗氧化剂防止细胞膜破坏,抑制铁死亡。Mao等[15]发现二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase,DHODH)与线粒体GPX4协同作用,通过将泛醌还原为泛醇来抑制铁死亡。

二、靶向铁死亡在肝病中的作用

铁死亡可见于不同类型的肝病,如酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、病毒性肝炎、肝纤维化、自身免疫性肝炎、肝细胞癌等,这表明靶向铁死亡可能对肝脏相关疾病的治疗有一定的价值。

(一)酒精性肝病 肝脏是酒精代谢的主要场所,过量饮酒产生的有毒代谢物作用于肝细胞后涉及许多细胞因子、趋化因子和活性氧的炎症级联反应,最终导致肝细胞死亡,这是酒精性肝病的基本病理过程[16]。有研究发现,酒精处理的小鼠肝脏中脂质代谢的下游标志物,前列腺素内过氧化物合酶 2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2,Ptgs2)mRNA被上调,腹腔注射铁死亡抑制剂(Fer-1)可减轻酒精诱导的肝损伤和脂质过氧化[17]。在另一项研究中,酒精性肝炎小鼠中脂蛋白-1的过表达促进了甘油三酯的合成和脂肪酸的氧化,加速了铁的积累,导致铁死亡和肝损伤的发生[18]。You等[19]发现酒精暴露增加了FNDC3B表达, FNDC3B缺失通过抑制AMP活化蛋白激酶(AMPK)来加重酒精诱导的肝脂肪变性。Zhou等[20]报道,肠道sirtuin1(SIRT1)缺乏可以抑制酒精性肝损伤小鼠的铁死亡,与野生型组相比,在肠道SIRT1敲除的小鼠肝脏中观察到铁代谢功能障碍改善,肝脏谷胱甘肽含量增加,脂质过氧化减弱。Zhang等[21]发现,富马酸二甲酯通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)途径抑制铁死亡,对酒精诱导的氧化损伤具有保护作用。总的来说,铁死亡与酒精性肝病密切相关,抑制铁死亡可作为该疾病治疗的新靶点。

(二)非酒精性脂肪性肝病 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)与酒精无关,其主要特征是肝脂肪积累过多。当除外酒精或其他次要因素导致肝内脂肪含量>5%时,绝大多数会发生单纯性脂肪变性,随着疾病的进展可发展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、肝硬化甚至肝细胞癌[22]。高铁饮食加剧了氧化应激和炎症反应,加速了小鼠NAFLD 向 NASH 的进展[23]。Tsurusaki等[24]证明了在NASH小鼠模型中,铁死亡抑制剂(trolox或去铁胺)可逆转脂质过氧化,同时抑制免疫细胞的浸润和炎症反应,从而改善肝功能。Qi等[25]观察到RSL3(一种铁死亡诱导剂)治疗可加重蛋氨酸/胆碱缺乏饮食(methionine and choline deficient diet,MCD)诱导的NASH小鼠的生化及炎症表现,而给予亚硒酸钠(一种GPx4激活剂)、甲磺酸去铁胺盐或利普他汀可阻碍脂质过氧化和细胞死亡,说明GPX4及其相关的铁死亡可能在NASH的发展中起主要作用。Li等[26]证明花生四烯酸代谢可触发铁死亡,靶向铁死亡可减轻MCD饮食诱导的NASH小鼠的病理状态。Liu等[27]发现烯酰辅酶A水合酶1(ECH1)在NASH患者活检标本和喂食MCD饮食的小鼠中显著增加,ECH1过表达极大地缓解了肝脏氧化应激。Zhu等[28]发现胸腺素β4(Tβ4)可有效改善高脂饮食(high-fat diet,HFD)诱导的NAFLD大鼠模型中的肝脂代谢相关指标,并抑制肝细胞系LO2中棕榈酸诱导的铁死亡。

(三)病毒性肝炎 病毒性肝炎的进展与铁死亡进程也存在一定的关联。在一项体外实验[29]中发现,甲型肝炎病毒 3C 蛋白酶(3Cpro)诱导的细胞死亡伴随着强烈的脂质过氧化,并被Fer-1有效抑制。此外,HBV X 蛋白 (HBx) 被证实通过 EZH2 介导抑制SLC7A11表达以促进急性肝衰竭中的铁死亡[30]。Su等[31]通过采用TCGA数据库进行病例对照研究,发现铁死亡相关基因 SLC1A5 可能是 HBV 相关肝细胞癌的极好预测因子,并与不良预后、晚期进展和免疫抑制微环境相关。Liu等[32]发现HBV可抑制 SRSF2 来调节 PCLAF 异常可变剪接,并通过 SRSF2/PCLAF tv1 轴减少铁死亡导致索拉非尼耐药。Yamane等[33]发现 HCV复制受到铁死亡的影响,并由脂肪酸去饱和酶2(fatty acid desaturase 2,FADS2)介导,通过抑制FADS2可以显著抑制铁死亡,进而增强了HCV的复制能力。

(四)肝纤维化 肝纤维化的机制涉及上皮或内皮屏障破坏、慢性炎症和肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)活化[34]。与正常肝脏相比,在纤维化肝脏中观察到HSC中的铁离子显著增加和脂质过氧化,说明铁死亡可能参与肝纤维化过程[35]。相关研究发现,天然药物通过靶向铁死亡作用于肝纤维化的治疗。蒿甲醚通过抑制SLC7A11重组蛋白介导的p53表达上调,间接导致GPX4失活,最终促进HSC中的铁死亡,改善肝纤维化[36]。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸衍生物,以铁蛋白吞噬介导的方式显著促进HSC的铁死亡来缓解肝纤维化[37]。此外,野生苦瓜提取物作为肝纤维化的潜在抗纤维化剂,通过调节ER应激和铁死亡来减弱脂多糖诱导的HSC活化[38]。RNA结合蛋白ZFP36 / TTP(ZFP36无名指蛋白)和ELAVL1 / HuR(ELAV样RNA结合蛋白1)在调节HSC的铁死亡中也起着重要的作用[39, 40]。Erastin或索拉非尼通过含溴蛋白 7 (BRD7)-p53 -溶质载体家族25 成员28 (BRD7-P53-SLC25A28)轴诱导HSC铁死亡来抑制小鼠肝纤维化[41]。TRF是一种富含血清的金属结合蛋白,已被证明可通过铁死亡缓解肝纤维化[42]。最近,Shen等[43]发现YTHDF1 N6-甲基腺苷(m6A)修饰可能通过促进BECN1 mRNA的稳定性并激活自噬来增强HSC铁死亡。因此,靶向铁死亡是治疗肝纤维化的一种潜在的策略。

(五)自身免疫性肝炎 有研究表明,用Fer-1处理后自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis,AIH)模型小鼠的Nrf2和血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)水平下调。抑制铁死亡显著改善了AIH对Nrf2/HO-1信号通路的影响,铁死亡可作为导致AIH的引发剂或中间介质[44]。另一项研究报道铁死亡与刀豆球蛋白A(ConA)诱导的AIH肝损伤中成纤维细胞生长因子4(FGF4)表达有关,表明FGF4可能是AIH细胞铁死亡发展中不可或缺的调节因子[45]。Zeng等[46]发现,AIH小鼠中抑制铁死亡也显著抑制了肝脏吲哚胺 2,3-双加氧酶 1(indoleamine 2,3-dioxygenase1,IDO1)的上调和硝化应激,表明IDO1依赖性铁死亡确定为治疗AIH的新靶点。

(六)肝癌 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)由于起病隐匿、治疗效果不佳等原因预后极差。索拉非尼作为多激酶抑制剂被广泛应用于治疗晚期HCC,通过抑制系统Xc-功能,进而抑制胱氨酸输入和GSH合成,最终导致脂质过氧化和铁死亡[47],铁螯合剂去铁胺(DFX)能明显抑制索拉非尼对肝癌细胞的毒性作用[48]。Bai等[49]发现氟哌啶醇作为一种sigma受体拮抗剂,能促进Erastin和索拉非尼诱导的铁死亡。Sun等[50]证实奎西辛巯基氧化酶1(quiescin sulfhydryl oxidase 1,QSOX1)通过驱动 EGFR 内体运输和抑制Nrf2 活化来促进索拉非尼诱导的HCC铁死亡。另外,纳米颗粒药物为铁死亡治疗肝癌提供了新的途径。Tang等[51]将索拉非尼与锰硅纳米颗粒结合,通过快速吞噬细胞内GSH导致肿瘤细胞发生铁死亡。Ou等[52]成功设计并制造了一种新型的低密度脂蛋白纳米颗粒,该颗粒以天然ω-3多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(LDL-DHA)为主要成分,可通过抑制GPX4活性来引发脂质过氧化和铁死亡,从而抑制肿瘤生长,并且还能扰乱HCC中氧化还原平衡。还有研究发现,低表达的视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)能有效促进索拉非尼引起的HCC细胞铁死亡[53]。γ干扰素(interferon γ,IFNγ)通过抑制系统Xc-使HCC细胞对铁死亡敏感[54]。

除了诱导铁死亡外,防止产生耐药性也是HCC治疗的替代策略。Sun等[55]发现索拉非尼以Nrf2依赖方式诱导金属硫蛋白-1G(MT-1G)的表达,这进一步促进了索拉非尼的耐药。Jennies等[56]发现TP53基因与Pro47(S47变异型)发生突变时,对Erastin导的铁死亡表现出显著的抵抗力。Zhao 等[57]发现富含乳酸的癌细胞可使 AMP 活化蛋白激酶(AMPK)失活,从而增强具有抗铁死亡特性的单不饱和脂肪酸的产生。Shang等[58]发现,铜蓝蛋白(ceruloplasmin ,CP)的缺失可促进厄拉斯汀和RSL3引起的HCC细胞的铁死亡,并导致细胞内亚铁离子和脂质ROS的积累。白血病抑制因子受体亚基α(LIFR)的缺失也可通过上调由核因子κ-B(NF-κB)介导的铁螯合细胞因子脂质运载蛋白2(LCN2)来诱导肝脏肿瘤的发生和对药物相关性铁死亡的抵抗[59]。所以,通过调控上述的分子靶标可降低索拉非尼的耐药情况。除此以外,YAP/TAZ和ATF4[60]、BAP1[61]、 DAZAP1[62]、 GSTZ1[63]、 lncRNA GABPB1-AS1[64]及环状RNA cIARS[65]等,都可通过靶向铁死亡在HCC的进展中发挥关键作用,这为进一步临床转化奠定了基础。

三、铁死亡的诱导剂和抑制剂

铁死亡是一把双刃剑,抑制铁死亡可用于预防铁过载和脂质代谢异常引起的各种慢性肝损伤,而诱导铁死亡有助于肝细胞癌的治疗。因此,研究铁死亡诱导剂和抑制剂的作用机制,对开发新的靶向铁死亡药物治疗不同类型的肝病意义深远。以下是经典铁死亡诱导剂和抑制剂的分类(表1和表2)。

表1 铁死亡诱导剂

表2 铁死亡抑制剂

四、总结与展望

综上所述,铁死亡涉及多种通路的复杂机制,并且参与各类肝病的发生与发展。例如,HBV感染会导致肝细胞铁死亡而加剧炎性进展,但是从宿主角度来说,肝细胞铁死亡又提醒宿主驱动免疫系统清除HBV。目前靶向铁死亡被很多学者视为治疗肝病新途径,但在铁死亡的研究中也存在一定的局限性。首先,研究结果多基于动物模型,缺乏可靠的临床证据,并且其治疗的安全性和毒副作用仍有待认证;其次,许多肝病可能同时具有多种细胞死亡模式,铁死亡与其他细胞死亡之间的联系需要进一步研究。最后,现阶段对铁死亡的研究多集中在HCC上,对其他肝脏疾病及铁死亡通路上游机制研究相对较少。未来在肝病的背景下,需要更多的证据来揭示铁死亡在不同时期疾病中的作用,寻找高特异性、灵敏性的生物标志物和检测方法来阐明铁死亡的特征。随着铁死亡相关研究的不断深入,势必将会对各类肝病的诊断及治疗提供新的临床策略。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。