基于1H-NMR的饮料中苯甲酸钠定量分析

王寿峰 ，林嘉荣，丁秀国，兰茜，霍明官，李慧

1.四川轻化工大学化学工程学院（自贡 643000）；2.酿酒生物技术与应用四川省重点实验室（四川轻化工大学）（宜宾 644000）；3.中昊晨光化工研究院有限公司（自贡 643201）

苯甲酸钠由于能够抑制酵母、霉菌及某些病菌的繁殖，被广泛运用于饮品及口服液中，是应用时期最长、使用量最大的食品防腐剂。苯甲酸钠过量摄入也会影响人体机体代谢平衡，引起人体过敏反应，从而导致许多慢性疾病[1]。在我国食品药品添加剂都受到严格把控，《中国药典》2020版第四部中口服液体制剂的合剂中使用苯甲酸钠时，用量（以苯甲酸计）不得超过0.3%（其钠盐的用量分别按酸计）[2]，GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定苯甲酸钠在碳酸饮料和特殊用途饮料中的最大使用量为0.2 g/kg，在风味饮料等中的最大使用量1.0 g/kg。在欧洲，苯甲酸盐由欧盟立法管制，软饮料中苯甲酸盐含量上限为0.15 g/kg，美国为0.10 g/kg[3-4]。随着生活水平及饮食安全意识的提高，如何简便快速测定饮品中的苯甲酸钠含量具有现实意义。

苯甲酸钠最常用的检查方法是高效液相色谱检测法[5-6]，此外荧光光谱标准加入法[7]、紫外分光光度计法等都显示各自的优点和局限[8]。GB 5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》介绍的液相方法过程较为繁琐，需要工作曲线，比较耗时。近年来，核磁定量法（qNMR）日益成为一种重要的分析方法[9]，在食品[10-14]、中药材[15-18]和生物样品分析中应用广泛[19-20]，仪器再现性和可靠性是核磁相对于其他分析技术的主要优势[21-27]。当前饮料市场前景广阔，产品复杂多样，试验建立一种快速简单、准确性高、专属性强的核磁定量方法，为饮品及口服液中苯甲酸钠的定量分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

雪碧纤维+清爽柠檬味饮料、怡泉+C柠檬味汽水、可口可乐无糖饮料、美年达饮料、飞马能量维生素运动饮料、东鹏特饮饮料、魔爪能量饮料、康师傅冰红茶、统一冰绿茶、玉川果园蜂蜜黄桃风味饮料、葡萄果味（台椰）饮料、希美乐蜂蜜芦荟风味饮料、王老吉植物凉茶饮料、加多宝凉茶饮料、欢乐家粒粒橙果粒果味饮品、统一蜜桃多水果饮料，市售；金银花露（哈尔潼）、金银花露（小葵花露）、金银花露（皇城）3种OTC口服液，购自当地连锁药店。

苯甲酸钠（纯度99.0%）、重水（D2O，纯度99.9%）、吡嗪（纯度99.0%）、甲酸（分析纯）、氨水（分析纯）、乙腈（色谱纯），上海泰坦科技有限公司；纯水，由Milli-QAcademic净化系统制得。

1.2 仪器与设备

Bruker Avance III HD 600 MHz核磁共振波谱仪，配备5 mm BBO探头（德国Bruker公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪，配备Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司）；ME204百万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；CP214千分之一电子天平（美国奥豪斯有限公司）；Vortex 3000型涡旋振荡器（德国Wiggens公司）；比重计（分度0.0005，衡水创纪仪器仪表有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 溶液的制备

标准溶液：精密称取307.51 mg苯甲酸钠标准品，置于100 mL容量瓶中，加入去离子水，超声溶解，定容，分别稀释成0.015，0.030，0.060，0.120，0.250，0.500，1.000和2.000 g/L的系列标准溶液。

内标溶液：精密称取3.224 mg吡嗪固体于10 mL量瓶中，加入D2O稀释溶解，定容，涡旋振荡，得内标溶液。

供试品溶液：准确吸取540 μL样品至核磁管中，碳酸饮料取样前需超声30 min脱气，加入60 μL含内标重水溶液，涡旋30 s混合均匀，待测。

液体样品密度测试：参照GB 5009.2—2016《食品相对密度的测定》中第三法 比重计法。

1.3.2 核磁分析与数据处理

采用Bruker标准脉冲序列noesygpprld用于水峰（δ=4.7）信号抑制，谱宽（SW）16.022，采样点数（TD）64 K，采样时间（AQ）3.41 s，接收增益（RG）32，扫描次数（NS）32，弛豫延迟（D1）27 s，检测温度298 K，样品检测前需等待5 min以稳定温度。

核磁共振谱图采用TopSpin4.1.3软件进行相位矫正，零点矫正（吡嗪峰δ=8.66），多点基线自动矫正；对位移δ=7.49～8.66间苯甲酸钠信号峰和位移δ=8.66吡嗪内标信号峰从根部平滑处手动积分，每个样品重复测试5次取平均值。

1.3.3 定量公式

苯甲酸钠质量按式（1）计算。

式中：Ws为苯甲酸钠质量，mg；Wr为内标物质量，mg；As为苯甲酸钠的特征峰的平均峰面积；Ar为内标峰的平均峰面积；Es为苯甲酸钠的质子当量；Er为内标物的质子当量；质子当量重量以分子量除以特征峰的质子数计算得到。

1.4 HPLC测试方法

参考《中国药典》2020版第四部中苯甲酸钠HPLC法进行验证分析。色谱柱Agilent Zorbax Eclipse XDBC18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温25 ℃；进样量20 μL。经由0.015，0.030，0.060，0.120，0.250，0.500，1.000和2.000 g/L的系列标准溶液验证，苯甲酸钠在0.015～2.000 g/L时与峰面积线性关系良好，线性方程为Y=75217X+88.739，相关系数r=0.9997，加标回收率为98.72%～99.21%。

2 结果与分析

2.1 弛豫时间

弛豫是指自旋平衡态的建立和重建的过程，从激发态回到平衡态所需时间为纵向弛豫时间（T1），它影响信号之间的相对积分。核磁定量应满足弛豫等待时间（D1）大于5倍的T1，此时弛豫率为99.3%。通过布鲁克核磁标准试验反转恢复法对苯甲酸钠和吡嗪弛豫时间进行测试，结果见表1，最大值为5.91 s，根据D1≥5T1-AQ（采样时间），故选定的弛豫延迟时间D1为27 s[28]。

表1 T1测试值

2.2 扫描次数

NMR灵敏度受硬件配置条件的限制，通常选择增加扫描次数来达到一定信噪比（The signal to noise ratio，S/N），信噪比随着扫描次数的平方根的增加而增加，但过多的扫描次数带来测试时间的延长，一般要求核磁定量峰的信噪比不小于150。取1 g/L的苯甲酸样品，采集核磁谱图，数据处理，结果如图1所示。扫描次数大于32后定量峰δ=7.88处积分值基本保持不变（设定内标吡嗪δ=8.66处积分值为1），此时的信噪比为1121.5，满足S/N≥150的定量条件，确定试验扫描次数为32次。

图1 不同扫描次数分别与积分值和信噪比谱图对比

2.3 基于1H-NMR谱的线性关系、检出限和定量限

将1.3.1的标准溶液采用纯化水进行梯度稀释，配制成0.015～2 g/L系列标准曲线溶液，以苯甲酸钠的物质的量浓度为横坐标（X，g/L），纵坐标（Y）为定量峰的积分值（内标积分为1），分别以δ=7.88的积分值和δ=7.49，δ=7.56，δ=7.88积分值总和进行线性回归拟合曲线，结果呈良好线性，结果如图2所示。得到回归方程Y=4.2633X+0.0035和Y=10.549X-0.0027，相关系数均为r=0.9999。1H-NMR方法的检出限（SLOD）和定量限（SLOQ）可以确定定量试验的精确度[29]，同时提供与其他分析方法的比较信息。基于果汁及口服液密度与水相差不大，结果表明定量限远小于国标最低限量0.2 g/kg，也小于欧盟、美国标准的最低使用量0.1 g/kg。由分析结果看，选取苯甲酸钠δ=7.88处单峰用于定量积分和选取全部核磁峰积分相差不大，都较准确。为了简便，最终选取δ=7.88处单峰为定量峰，该峰与其他峰区分良好，干扰少，便于准确积分。

图2 不同浓度苯甲酸钠标准品的1H-NMR谱图

2.4 精密度

按照拟定的1.1.3方法，取雪碧纤维+清爽柠檬味饮料（A）样品，平行测定6次，将积分值导入式（1）中计算苯甲酸钠的质量，然后通过饮料的比重ρ=0.9869（20 ℃）换算成浓度，以g/kg表示，结果见表2，SRSD为0.77%，表明测定结果精密度良好。

表2 A饮料中苯甲酸钠样品的1H-NMR定量结果（n=6）

2.5 方法的加标回收率

取3份雪碧纤维+清爽柠檬味饮料（A）样品，按拟定方法制备样品溶液，取1.0 g/L的标准溶液，向3支核磁样品管中分别加入100，300和500 μL（含苯甲酸钠0.1，0.3和0.5 mg），混匀，检测。结果见表3，测得加标回收率介于98.06%～99.93%，SRSD为1.10%～1.91%。

表3 A饮料中苯甲酸钠回收率及SRSD（n=3）

2.6 市售样品测定

对采购19种不同类别供试品进行1H-NMR测样，核磁谱图如图3所示。为简化操作步骤样品未调pH，样品酸碱度的不同导致定量峰在δ=7.8～8.0略有漂移，δ=7.4～7.6的峰可作为苯甲酸钠的参照峰，定量峰周边无干扰。采用国标方法测试样品的密度，将核磁定量结果和液相色谱定量结果最终换算成g/kg。根据药典的HPLC方法检测并与1H-NMR方法检测结果比较，结果如表4所示。试验样品中，检测的16种市售饮品均符合GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》，茶饮料和植物饮料中均未检出苯甲酸钠。3种口服液金银花露样品符合《中国药典》2020版四部中口服液体制剂含量标准，苯甲酸钠含量小于3 g/kg，其中金银花露（皇城）中未检出。2个方法定量结果的相对偏差小于5%，说明核磁定量的可行性和准确性。

图3 不同类别饮料中苯甲酸钠的1H-NMR谱图对比

表4 苯甲酸钠供试样品的1H-NMR和HPLC结果

3 结论与讨论

随着食品行业的不断发展，饮料产品及种类也越来越丰富，尤其是防腐剂在各种食品、产品中的安全使用范围极为关注，针对市售软饮料中苯甲酸钠的含量检测，采用1H-NMR作为检测手段，建立饮料中苯甲酸钠含量的定量分析方法。结果表明，在0.015～2 g/L范围内线性良好，精密度、重复性及加标回收率均满足含量测定要求。使用HPLC法对1H-NMR测试结果进行验证，结果非常接近，相对偏差小于5%，证明该定量方法的可信度和可行性。核磁定量方法优势在于重现性好，不需要标准品及工作曲线，耗时短。检测的16种市售饮品均符合国标，茶饮料和植物饮料样本中苯甲酸钠未检出。3种口服液金银花露样品中苯甲酸钠含量符合《中国药典》2020版要求，个别样品中未检出。试验建立的方法简单快捷、无损耗、灵敏度高，可为企业及市场监管部门提供重要参考，有较广泛的应用前景。