酱香型白酒酿造微生物多样性研究进展

刘晓柱，黄名正，唐维媛，于志海，许存宾

贵州理工学院食品药品制造工程学院（贵阳 550003）

酱香型白酒作为我国主流香型之一的白酒，历史悠久，源远流长[1]。以红缨子糯高粱为主要酿造原料，通过高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒等工艺生产而成的酱香型白酒，酱香突出、香气优雅细腻，酒体丰满醇厚[2]。酱香型白酒独特的香气特性和风味特征，既受酿造原料的影响，也受发酵工艺及微生物代谢活动的制约[3]。

酱香型白酒复杂的固体发酵工艺涉及大量酿造微生物的相互作用，包括细菌类、真菌类（酵母菌、霉菌）及放线菌类微生物种群[4]。不同的酱香型白酒酿造工序中微生物种属多样性与动态变化特点不同，由此产生的酒体风格特性差异较大，表明酱香型白酒酿造微生物具有多样性和时空特异性，也暗示酱香型白酒酿造微生物与酒体风味特性的重要关联性。综述近年来国内在酱香型白酒酿造微生物多样性方面的研究进展，以期为酱香型白酒酿造微生物的选育和酒体品质调控提供理论参考。

1 酱香型白酒酿造工序微生物多样性

酱香型白酒生产工艺较为独特，1年为1个完整的生产时间，含2次投粮、9次蒸煮、8次发酵、7次取酒，即为“12987”工艺。酱香型白酒整个生产工艺与微生物密切相关的环节包括制曲、堆积发酵、窖池发酵等环节[5]。

1.1 制曲

曲为酒之骨，好曲出好酒。高温制曲是酱香型大曲主要特点，通过高温筛选、富集耐热微生物种群，为酱香型白酒生产提供糖化剂和发酵剂，进而影响酱香型白酒的风格和品质的形成[6]。

孙利林等[7]采用高通量测序技术比较2个酱香酒厂大曲微生物种群结构组成，结果发现两酒厂大曲优势细菌主要为杆菌属（Bacillaceae），优势真菌主要为曲霉属（Aspergillus）、嗜热子囊菌属（Thermoascus）和嗜热真菌属（Thermomyces）。尽管两酒厂大曲细菌和真菌种群组成相似，但它们的丰度却不尽相同，如2个酒厂大曲中Aspergillus占比分别为55.00%和7.58%，Thermoascus占比分别为28.11%和49.85%。黄娜等[8]比较不同颜色（黑色、褐色、黄色）酱香型大曲微生物的群落结构组成，结果发现不同颜色大曲特征微生物具有较大差异，Thermomyces、嗜糖假单胞菌属（Pelomonas）、螯台球菌属（Chelatococcus）、副球菌属（Paracoccus）为黄色大曲特征微生物，被孢霉属（Mortierella）为褐色大曲特征微生物，Thermoascus和镰刀菌属（Fusarium）为黑色大曲特征微生物。不同颜色大曲理化指标（酸度、还原糖、淀粉、酯化力）、酶活（糖化酶、液化酶）、挥发性风味物质也不相同，可能是由于微生物种群差异造成的。庞泽敏等[9]对比分析北京与贵州酱香大曲微生物种群组成差异，结果表明两个地区大曲优势细菌属为Bacillaceae，包括海洋芽孢杆菌属（Oceanobacillus）、枝芽孢杆菌属（Virgibacillus）、克氏杆菌属（Kroppenstedtia）及Scopulibacillus等，优势真菌属则为Thermoascu、Thermomyces和Aspergillus。谢丹等[10]探究酱香型大曲储存过程中微生物群落变化特点，结果发现大曲中可培养微生物总体数量先增加后降低，优势细菌为乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、肠杆菌属（Enterobacter）及Kroppenstedtia；优势真菌为Trichomonascus、Thermomyces及丝衣霉属（Byssochlamys）。

此外，黄晓宁等[11]比较酱香型大曲与浓香型大曲微生物多样性，结果发现2种大曲中优势细菌为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），优势真菌差异较大，伞状毛霉（Lichtheimiacorymbifera）和多变拟青霉（Paecilomycesvariotii）为酱香型大曲优势真菌，浓香型大曲优势真菌为谢瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri）和米曲霉（Aspergillus oryzae）。

1.2 堆积发酵

白酒的糖化堆积发酵暴露在酿造环境中，与空气相接触，可网罗、富集大曲与环境微生物，有助于微生物代谢产生多种风味物质，达到培菌增香目的，为窖池发酵做准备[12]。但酱香型白酒堆积发酵与其他香型白酒堆积发酵不同，其发酵温度较高，达50 ℃以上。因而，酱香型白酒堆积发酵微生物种群类别及其变化特点与其他香型白酒相比具有一定差异性。

吴成等[13]采用高通量测序技术与纯培养相结合方法解析造沙轮次堆积发酵微生物演变规律，研究发现堆积发酵不同阶段微生物种群组成不同，在堆积发酵的前期和中期，优势细菌为Kroppenstedtia、Bacillus、UnclassifiedThermoactinomycetaceae及UnclassifiedBacillaceae。优势真菌为Thermomyces、毕赤酵母属（Pichia）、Byssochlamys、Aspergillus。在堆积发酵末期，优势细菌和真菌则演变为乳杆菌属（Lactobacillus）和Pichia。这些微生物菌群是驱动造沙轮次堆积发酵的优势微生物。进一步分析微生物种群与酒醅理化指标的关系发现，Lactobacillus、Acetobacter、Pichia、酵母菌属（Saccharomyces）与酒醅温度、葡萄糖含量之间呈现显著正相关的关系，而与水分呈现显著负相关的关系。姜明慧等[14]采用单一的高通量测序技术研究酱香型白酒下沙轮次堆积发酵6个阶段（起堆、堆积第2天、复式堆积前、复式堆积后、复式堆积10 h、复式堆积高温点）细菌与真菌群落变化规律。在堆积发酵6个时间点检测到细菌属的微生物分别为113，134，176，169，198和207个，乳酸菌属（Lactobacillus、Weissella、Enterococcus、Pediococcus、Enterobacter）为其优势细菌；检测到真菌属微生物分别为51，79，60，105，121和166个，生香酵母（Dipodascus、Dipodascaceae、Trichosporon）为其优势真菌。该研究与吴成等[13]鉴定造沙堆积发酵阶段优势微生物种群具有一定差异性。推测其原因可能是地域不同导致，吴成等研究对象为南方酱香（贵州）白酒堆积发酵酒醅，姜明慧等研究对象则为北方酱香（山东）白酒堆积发酵酒醅。

涂昌华等[15]分析下沙轮次与造沙轮次堆积发酵过程中酒醅微生物与温度的关系，研究发现在堆积发酵的初期，细菌群体数量高于酵母菌，随着堆积发酵进行，细菌和酵母菌的数量均逐渐增加。酒醅温度升高，抑制微生物数量的增加，温度达到50 ℃后，酒醅中细菌和酵母菌的数量均降低。

除下沙和造沙轮次外，不少学者还对酱香型白酒其他轮次堆积发酵微生物多样性进行研究。黄蕴利等[16]、张春林等[17]鉴定出后壁门（Firmicutes）、变形门（Proteobacteria）、子囊门（Aseomycota）、担子门（Basidiomycota）为第2轮次堆积酒醅主要细菌和真菌菌群。其中，优势细菌为Bacillus、Oceanobacillus、裸胞壳属（Emericella）、Lactobacillus、Thermoactinomyces等，优势真菌属为Aspergillus、Pichia、假丝酵母属（Candida）、威克汉姆酵母属（Wickerhamomyces）等。张春林等[17]研究发现酒醅淀粉和总酸含量影响Aspergillus、Emericella菌群丰度，两者呈正相关，酒醅温度、粗蛋白和还原糖含量也影响Emericella菌群丰度，它们之间呈负相关。邓子文等[18]对襄阳市酱香型白酒第4轮次正常堆积发酵、“腰线”微生物多样性进行比较分析，结果发现“腰线”酒醅中乳酸菌、细菌、酵母及霉菌的丰度均高于正常发酵酒醅；β多样性分析结果表明，“腰线”处酒醅中Bacillus、Byssochlamys丰度显著高于正常酒醅，而Pichia、酵母属（Saccharomyces）、有孢圆酵母属（Torulaspora）和接合酵母属（Zygosaccharomyces）丰度则显著低于正常酒醅。吴成等[19]从第4轮次堆积发酵酒醅中鉴定出Kroppenstedtia、Sphingobium类细菌和Kazachstania、Aspergillus类真菌。该研究进一步发现酒醅的水分与Pichia呈正相关，与Thermomyces、Byssochlamys、Aspergillus等真菌呈负相关；酒醅淀粉、还原糖含量与Bacillus呈正相关，与Pichia呈负相关。此外，酒醅香气物质中的醇类含量与酵母菌显著正相关，酸类、酯类等含量与丝状真菌和细菌显著正相关。Wang等[20]对酱香型白酒7轮次堆积发酵酒醅微生物进行全面解析，不同轮次酒醅微生物种群组成不同，各有特点。但不同轮次酒醅也具有相似的优势微生物种群，如Bacillus、慢生芽胞杆菌属（Lentibacillus）、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Lactobacillus等细菌类以及Thermomyces、Byssochlamys、Thermoascus、Aspergillus等真菌类。

1.3 窖池发酵

堆积发酵以培菌为主要目的，发酵结束后酒醅便转移至窖池内，进入窖池发酵阶段。酱香型白酒发酵窖池一般由长条石或方块石砌成，窖底以窖泥为主。酒醅转移至窖池内，窖泥封顶后进行约30 d的窖池发酵。针对窖池发酵阶段，主要分析窖池内酒醅[21]和窖底泥微生物多样性[22]。

王莉等[23]发现窖底泥微生物多样性低于酒厂周边环境土壤微生物多样性。利用高通量测序技术鉴定出窖底泥主要微生物为乳杆菌科（Lactobacillaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）等厌氧微生物。胡峰等[24]对“大回酒”（第3，第4和第5轮次）窖池发酵酒醅中酵母菌、细菌和霉菌种群变化规律的研究结果发现，随着发酵进行，窖池内酵母菌与霉菌数量逐渐降低，细菌数量在发酵初期降低，发酵中后期保持稳定。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces baillii）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）分别被鉴定为“大回酒”窖池酒醅中优势酵母菌和优势细菌，暗示这些微生物种群对“大回酒”酱香典型体的形成具有不可或缺的作用。

此外，张晶等[25]比较2个车间窖池微生物多样性差异性，结果发现Acetilactobacillus、Bacillus和Kroppenstedtia为窖池内优势细菌属，Pichia、Saccharomyces、Byssochlamys为窖池内优势酵母菌属；Bacillus、Kroppenstedtia和Pichia、Saccharomyces在2个车间的窖池丰度具有显著性差异，车间L4窖池内细菌和酵母菌丰度整体高于车间L1窖池；酒醅中葡萄糖、乙酸、乙醇含量的变化是驱动微生物种群演化的内在因子，证实发酵初始微生物多样性影响发酵过程理化因素的变化，进而影响微生物种群多样性，最终调控发酵代谢多样性。

2 酱香型白酒酿造环境微生物多样性

胡小霞[26]对茅台镇酱香型白酒酿造环境中细菌、真菌群落结构进行解析。酿造环境包括车间内和车间外两部分，车间内包括玻璃、晾堂地面、配电箱与消防箱表面以及不易打扫的角落等场所，车间外主要为地面部分。研究从酿造环境样品中共检测到23个门、561个属细菌，其中鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、泛菌属（Pantoea）、Kroppenstedtia、不动杆菌属（Acinetobacter）、Enterobacter、Lentibacillus、假单胞菌属（Pseudomonas）、unclassified fEnterobacteriaceae为各酿造区域共有优势细菌属微生物种群；该研究还从酿造环境中检测到4个门、212个属真菌，其中Wallemia、Aspergillus、覆膜孢酵母属（Saccharomycopsis）、Thermoascus、Wickerhamomyces、unclassified fSaccharomycetaceae为各酿造区域共有优势真菌属微生物种群。

3 酱香型白酒酿造微生物分布时空特异性

3.1 时间特异性

左乾程[27]解析不同季节清酱香型白酒发酵微生物菌群结构多样性，结果发现从春、夏、秋、冬4个季节发酵酒醅中共鉴定出24个门、499个属细菌，6个门、251个属真菌。优势细菌鉴定为Bacillus、葡糖杆菌属（Gluconobacter）、Lactobacillus、Enterobacter、Kroppenstedtia等19个属，随着时间的变化，4个季节发酵酒醅中细菌演变规律存在一定差异性，最终均演变为Lactobacillus为主导地位。优势真菌鉴定为Saccharomyces、Saccharomycopsis、Wickerhamomyces、Zygosaccharomyces、有孢圆酵母属（Torulaspora）等20个属。与清香型相比，Gluconobacter、埃希氏杆菌属（Escherichia）、Kozakia等为清酱香型白酒特有优势细菌属微生物，Saccharomyces、Cyberlindnera、黄丝曲霉属（Talaromyces）为清酱香型白酒特有优势真菌属微生物。

有研究揭示不同轮次酱香型白酒酿造微生物种属多样性及动态变化。Xu等[28]分析第1轮次（包括下沙和造沙）至第3轮次窖池微生物多样性变化，结果发现第1轮次和第2轮次发酵起始阶段优势细菌均为枝芽胞杆菌属（Virginacil）和Oceanobillus，随着发酵的进行，它们的丰度逐渐降低；相反，Lactobacillus的丰度则逐渐增加，并逐渐取代Virginacil、Oceanobillus成为优势菌，并维持至该轮次发酵结束；第3轮次发酵起始优势种群包括Lactobacillus、Oceanobacillus、Virgibacillus。Lactobacillus的丰度随发酵进行逐渐降低，Oceanobacillus和Virgibacillus的丰度则逐渐增加；前3个轮次酒醅中优势真菌为伊萨酵母属（Issatchenkia）、Byssochlamys、Saccharomyces，Byssochlamys在前3个轮次发酵起始时为其优势菌，丰度随发酵进行而逐渐降低，在发酵中后期其主导地位被其他种属酵母所取代。Wang等[29]研究第5和第6轮次酒微生物种群结构组成与风味物质之间的关系。从第5轮次和第6轮次堆积发酵和窖池发酵酒醅中鉴定出的优势细菌属，分别为Lactobacillus、Oceanobacillus和Virgibacillus，与前3个轮次优势微生物相同[28]。Oceanobacillus、Virgibacillus在堆积发酵的第1和第3天为优势菌，Lactobacillus为第5天优势菌。Oceanobacillus、Virgibacillus为窖池发酵第1天优势菌，在发酵第15天优势菌演变为Lactobacillus，并维持到发酵结束（第30天）。尽管2个轮次优势微生物种属类别相同，但它们的丰度组成具有一定差异性。如Lactobacillus在第6轮次堆积发酵的第1天丰度为0.15±0.06，其在第5轮次相同时间点的丰度仅为0.04±0.02，低于第6轮次。第5轮次和第6轮次堆积发酵和窖池发酵酒醅优势真菌为Issatchenkia、Thermoascus和Thermomyces。在堆积发酵和窖池发酵的第1天，Thermoascus和Thermomyces的丰度高于Issatchenkia。但Issatchenkia的丰度迅速增加，并在发酵的第3天成为优势菌。而其他优势真菌的丰度，如Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus则逐渐降低。

此外，万勇等[30]采用活菌计数法比较酱香型白酒7个轮次酒醅中微生物群体变化规律。研究发现：堆积发酵酒醅中微生物数量呈现先增加后降低趋势，而出窖酒醅中微生物群体数量呈现整体下降趋势；同一轮次堆积发酵酒醅不同位置微生物数量不同，中、下层微生物数量高于上层。

3.2 空间特异性

酱香型白酒主要产于贵州、四川、湖南、山东、北京等地，因而在地域上又可被分为南方酱香和北方酱香。由于酿造微生物分布具有空间特异性，造就不同地域酱香白酒风味迥异。

黄慧芹等[31]研究发现第4轮次入窖酒醅中优势细菌和真菌分别为Lactobacillus、Virgibacillus、Kroppenstedtia和Thermoascus、Aspergillus、Issatchenkia。在整个发酵过程中以14 d为分界线，发酵前期（0～7 d）优势细菌为Virgibacillus、Kroppenstedtia，发酵中期开始（14 d），优势细菌演变为Lactobacillus。吴怡璇[32]对北方酱香第7轮次（第8次发酵）核心微生物进行鉴定。从中鉴定出优势微生物为Issatchenkia、Thermomyces、Lactobacillus、弯孢霉菌属（Cutaneotrichosporon）、Byssochlamys。这些核心微生物与主要挥发性物质（如正戊酸、异戊醇、乳酸乙酯）含量显著正相关。与南方酱香（贵州地区）相比，棒状杆菌属（Corynebacillus）、糖多孢菌属（Saccharopolyspora）为北方酱香型所特有优势细菌属，Cutaneotrichosporon、弯曲假丝酵母属（Apiotrichum）、Issatchenkia、Kazachstania，为北方酱香所特有优势真菌属。

王欢[33]利用高通量测序技术对贵州茅台镇（南方酱香）第3，第4和第5轮次堆积发酵酒醅微生物进行解析，结果发现：微生物菌群多样性随发酵轮次的增加而增加；鉴定出Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia为第3轮次酒醅优势细菌属为Oceanobacillus、Lentibacillus、Bacillus、Staphylococcus、Kroppenstedtia为第4轮次酒醅优势细菌属，Bacillus、Oceanobacillus、Lentibacillus、Kroppenstedtia为第5轮次酒醅优势细菌属；鉴定出Saccharomycopsis、Zygosaccharomyces为第3轮次酒醅优势真菌属，Saccharomyces、unclassified_f_Saccharomycetaceae为第4轮次酒醅优势真菌属，unclassified fSaccharomycetaceae、Monascus、Saccharomycopsis、Aspergillus为第5轮次酒醅优势真菌属。结果表明，第3，第4和第5轮次优势真菌差别较大。

此外，庞泽敏等[9]比较南北方大曲微生物差异性，结果发现2个地区大曲优势细菌均为Virgibacillus、Kroppenstedtia、Oceanobacillus、Scopulibacillus，优势真菌均为Thermoascus、Thermomyces、Aspergillus。高亦豹等[34]采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳技术比较高温大曲和中温大曲细菌群落结构，从高温大曲中鉴定出所特有的细菌物种Thermoactinomyces sanguinis。

4 机械设备对酱香型白酒酿造微生物多样性的影响

蒋红军[35]比较传统摊晾与机械摊晾场地微生物的差异，结果发现传统摊晾场地细菌类微生物繁殖较快，种类较丰富、数量较多，而钢板作为摊晾设备，由于水分蒸发较快，导致其表面细菌类微生物种类较单一，主要为芽孢菌，数量也较少。传统摊晾场地酵母菌数量为机械摊晾设备的10～100倍，2种摊晾方式对霉菌数量影响不大，均以黄曲霉和根霉为主。

王欢等[36]比较机械化生产的酱香型白酒7轮次堆积发酵细菌群落特点，共检测出14个门，456个属的细菌。优势细菌属为Bacillus、Lactobacillus、Acinetobacter、Kroppenstedtia、Rhodococcus、Weissella、Oceanobacillus、Caulobacter、Lentibacillus、Sphingomonas、Thermoactinomyces、Pediococcus。Rhodococcus、Caulobacter被鉴定为机械化酿造过程中特有细菌属。左乾程等[37]比较机械制曲与传统制曲细菌群落演变规律，结果发现，机械制曲中细菌属（84个）数量高于传统制曲（82个），Pediococcus、Tepidimicrobium为机械制曲特有属细菌。随着发酵进行，细菌群落丰富性降低，逐渐演变为单一Firmicutes为主导的细菌群落。张瀚之等[38]对比机械化生产中不同轮次堆积发酵酒醅中真菌群落多样性，Thermomyces、Thermoascus、Aspergillus、Torulaspora、Byssochlamys、Candida、Wickerhamomyces被鉴定为机械化生产中的特有真菌属微生物。

5 结语与展望

近年来，酱香型白酒在中国白酒产业中异军突起，成为白酒产业中的中坚力量。2021年酱香型白酒产能仅占白酒产能的8.4%，但营收和利润却高达31.5%和45.8%。微生物作为酱香型白酒生产的“生物工厂”，其对酱香型白酒品质的影响不言而喻。尽管对酱香型白酒酿造微生物的研究已取得一定进展，但仍存在一些问题亟待解决或深入研究。一是关键微生物种属对酒体的贡献度仍不清晰。一直以来，酱香型白酒主体香型物种未被鉴定出[39]，优势微生物种属对酒体香气物质的贡献度仍未被完全揭示清楚。二是不同种属微生物间互作关系还有待进一步解析。白酒固态发酵是一个多菌种共同发酵体系，各类微生物之间相互影响、相互制约的关系还不明确。三是随着交叉学科的快速发展和人口出生率的持续降低，白酒生产机械化和智能化转型势在必行，但机械化和智能化对酱香型白酒酿造微生物和酒体品质的影响还需要更多证据的支撑。四是新技术植入酱香型白酒生产和研究还需加强。组学技术的出现和飞速发展，也为酱香型白酒的生产和研究提供机遇，如风味组学、宏基因组学、脂质组学等技术在解析微生物种群多样性、微生物种群间互作以及关键风味物质等方面具有无以比拟的优势。因而多组学技术联合生物信息学、分子生物学、生物统计学技术将会被越来越多地应用于解析酱香型白酒微生物种群多样性研究中。五是功能微生物在酱香型白酒生产中的应用还比较少。解析酱香型白酒酿造微生物多样性目的在于通过生产调控，强化功能微生物的作用，改善酒体品质。已有一些研究探索性地将某些种属的微生物（如异常威克汉姆酵母[40-41]、乳酸菌[42]）应用于白酒生产，但还有更多种属的微生物有待于应用于酱香型白酒的生产。