基于JNK/MAPK信号通路分析脊痛消胶囊治疗腰椎间盘突出症的作用机制*

谢希,李玲,石晔,邓汉清,娄宏君,高曦

1.黑龙江中医药大学第一临床医学院,黑龙江 哈尔滨 150040; 2.湖南中医药大学中医学院,湖南 长沙 410208;3.湖南中医药大学中西医结合学院,湖南 长沙 410208; 4.湖南中医药大学第一临床医学院,湖南 长沙 410208;5.黑龙江中医药大学附属第一医院,黑龙江 哈尔滨 150040

腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)是因腰椎间盘变性、纤维环破裂、髓核组织突出压迫和刺激腰骶神经根、马尾神经所引起的一种综合征[1]。LDH的临床表现主要为腰背部疼痛、僵硬、活动受限、下肢麻木,严重者甚至可出现大小便困难等症状。目前,针对LDH的治疗可分为保守治疗和手术治疗,其中保守治疗是大多数初发患者的首选方式,主要形式为卧床休息、药物治疗、运动疗法、硬膜外注射、腰椎牵引和中医治疗等,且多数患者经过保守治疗后临床症状得到减轻,有的还会出现腰椎间盘重吸收现象[2]。研究显示,经过中医保守治疗后,320例患者的腰椎间盘突出率显著下降,其中189例患者的突出吸收率>30%,81例患者的突出吸收率>50%,表明中医保守治疗LDH具有潜在优势[3]。脊痛消胶囊是黑龙江中医药大学附属第一医院院内制剂,由当归、泽泻和川芎等14味中药组成,具有清热利尿、活血化瘀、通经止痛的功效,临床常用其治疗LDH和颈椎病,疗效确切[4-6]。该药组分复杂,作用靶点繁多,深入阐明其治疗LDH的物质基础和药效机理对于其临床运用和现代药理学研究具有重要价值。近年来,网络药理学成为研究中药组方有效成分体系与病证复杂生物系统相互作用关系的重要方法,其核心理念为“网络靶标”,将方药和病证映射于生物分子网络,从分子和信号通路等层面对网络进行解析,根据生物分子在网络中的重要性度量,筛选关键靶标和有效成分,从而对方药-疾病的作用机制和有效成分进行机制性地计算和预测[7]。本研究借助网络药理学的方法对脊痛消胶囊治疗LDH的靶标和成分进行预测,再进一步利用分子对接技术和体外实验对预测结果进行验证,以期为脊痛消胶囊的临床运用提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 脊痛消胶囊有效成分和靶点收集在中药系统药理学(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology,TCMSP)数据库中收集脊痛消的化学成分,以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18为条件筛选有效成分,并收集其作用靶点;由于地龙和五灵脂未被TCMSP数据库收纳,故在BATMAN-TCM数据库收集五灵脂的化学成分和作用靶点,在中医药资料@Taiwan数据库收集地龙的化学成分,并将检索到的化学成分导入SwissADME数据库,以Gatrointestinal absorption为High,Drug likeness 5个指标中满足两个为条件筛选两者的有效成分,然后以Probability>0为条件在Swiss Target Prediction数据库预测其作用靶点。利用Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)对蛋白靶点名称进行校正,以“Homo sapiens”为种属来源,删除未经验证和无对应基因名的蛋白靶点,得到蛋白靶点的官方基因名称。

1.2 LDH靶点收集在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)、OMIM数据库(https://www.omim.org)和DisGeNET数据库(https://www.disgenet.org)中以“lumbar disc herniation”为关键词检索疾病相关靶点。

1.3 PPI网络构建与关键靶点筛选利用Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)对成分靶点和LDH靶点进行映射获得潜在靶点,随后将交集靶点导入String数据库(https://string-db.org),设置置信度为0.7,隐藏网络中孤立的节点,将结果保存为TSV格式文件并在Cytoscape 3.9.1软件中对PPI进行分析,构建可视化网络,利用软件中的插件CytoNCA筛选关键靶点。

1.4 “药物-活性成分-潜在靶点”网络构建将交集靶点与有效化学成分导入Cytoscape 3.9.1软件构建“药物-活性成分-潜在靶点”网络。

1.5 富集分析将交集靶点导入R Studio软件,利用clusterProfiler包对潜在靶点进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析、京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,设置P<0.05,物种为Homo sapiens,再通过ggplot2包对分析结果进行可视化。

1.6 分子对接从Protein Data Bank(PDB)数据库(https://www.rcsb.org)下载各靶点基因的蛋白质晶体结构,从TCMSP数据库下载药物活性成分的3D结构,运用AutoDockTools软件对受体蛋白和配体小分子进行加氢、平衡电荷等修饰。利用AutoDock Vina软件对受体蛋白与配体小分子进行分子对接,结合能打分,Pymol和Discovery Studio软件将对接结果进行可视化。

1.7 动物实验验证

1.7.1 实验动物SPF级雄性SD大鼠50只,购自湖南斯莱克景达实验动物公司,体质量200～220 g,许可证号:SYXK(湘)2019-0009,饲养温度 22～24 ℃,相对湿度40%～60%。本研究经黑龙江中医药大学伦理委员会审批通过,批号:2022030102。

1.7.2 主要实验试剂与仪器脊痛消胶囊(黑龙江中医药大学附属第一医院,每粒0.25 g,批号:黑药制字Z20100379);塞来昔布胶囊(辉瑞制药有限公司,每粒0.2 g,批号:国药准字J20140072);c-JUN、p-c-JUN、c-FOS、p-c-FOS、JNK、p-JNK、p38-MAPK和p-p38-MAPK抗体(货号:bsm-42050M、bs-1735R、bsm-33204M、bs-12910R、bs-2592R、bs-4163R、bs-0637R、bs-2210R,北京Bioss);IL-6、IL-10、TNF-α的ELISA试剂盒(货号:E-EL-R0015c、E-EL-R0016c、E-EL-R2856c,武汉Elabscience);BCA试剂盒(C05-02001,北京Bioss)。多功能酶标仪(Infinite®M Nano+,瑞士Tecan);石蜡切片机(A0820,美国华纳-兰伯特技术公司);电泳仪(Mini-ProteanTetra,美国Biorad);微量移液器(FinnpipetteTMF2,美国Thermo)。

1.7.3 造模与分组50只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、脊痛消胶囊低剂量组、脊痛消胶囊高剂量组和塞来昔布组,参考杜肖勋等[8]的造模方法,其中模型组、脊痛消胶囊组、塞来昔布组中取大鼠第3、4尾椎椎间盘2个,以10 mL针头刺破椎间盘正中纤维环,暴露并取出髓核,并将其置于硬膜外腔暴露处,随后逐层缝合,并于伤口处涂抹红霉素眼膏。假手术组大鼠仅暴露椎间盘,不作其他处理。按照人与动物体表面积换算法,脊痛消胶囊低剂量组和高剂量组分别按照0.57 g·kg-1和1.14 g·kg-1灌胃给药,塞来昔布组按照0.02 g·kg-1灌胃给药,假手术组给予等量体积生理盐水,14 d后处死动物。

1.7.4 组织蛋白测定水合氯醛麻醉后,取大鼠椎间盘髓核组织,PBS冲洗两次,RIPA提取总蛋白,BCA法定量蛋白浓度,电泳2 h,转移到PVDF膜,封闭2 h,按照11 000 比例孵育一抗过夜,TBST洗涤3次,每次10 min,按照15 000比例孵育二抗 2 h,TBST洗涤,显影,Image J软件对结果进行分析。

1.7.5 血清细胞因子测定大鼠行腹主动脉采血,离心后收集血清,免疫酶联吸附法检测血清中白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-10和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,严格按照试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 脊痛消胶囊有效化学成分和靶点收集收集到脊痛消胶囊有效成分:白芍13种、车前子9种、川芎7种、泽兰2种,当归2种、杜仲28种、莪术3种、防己3种、黄芪20种、三棱5种、延胡索49种、泽泻10种、五灵脂7种和地龙5种,去重后共获得139种活性成分。收集到作用靶点:白芍123个、车前子195个、川芎42个、泽兰69个、当归69个、杜仲532个、莪术24个、防己47个、黄芪462个、三棱140个、延胡索1 098个、泽泻9个、五灵脂115个和地龙248个。靶点去重后获得479个靶点,见图1。

图1 脊痛消胶囊与LDH靶点映射结果

2.2 LDH靶点收集在3个数据库中共检索到590个与LDH相关的靶点,见图1。

2.3 PPI网络构建与关键靶点筛选将上述获得的化学成分靶点与TNBC靶点取交集后,得到潜在作用靶点,共84个,将交集靶点导入String数据库(https://string-db.org),设置置信度为0.7,隐藏网络中孤立的节点,将结果保存为TSV格式文件并在Cytoscape 3.9.1软件中,对蛋白相互作用结果进行分析,构建可视化网络,见图2,利用Cytoscape 3.9.1软件中的插件CytoNCA进行关键靶点筛选,根据度值获得排名前10位的核心靶点,见表1。

表1 核心靶点信息

图2 PPI可视化结果

2.4 “药物-成分-靶点”网络构建将交集靶点与有效化学成分导入Cytoscape3.9.1软件构建“药物-成分-靶点”网络,该网络共217个节点,594条边,其中紫色三角形节点代表药物,黄色圆形节点代表靶点,绿色菱形节点代表活性成分,度值越大者节点越大,见图3。

图3 “药物-成分-靶点”网络

借助R语言进行生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)分析,制作结果排名前10位的柱状图和气泡图。生物过程主要涉及上皮细胞增殖、腺体发育、对脂多糖的反应、对细菌起源的分子的反应、对活性氧的反应、肌肉细胞增殖、对氧化应激的反应、伤口愈合、对MAPK信号通路的正调控等;细胞组成主要包括膜筏、膜微区、含有胶原蛋白的细胞外基质、囊泡腔、细胞外颗粒腔、血小板α颗粒管腔、黏着斑等;分子功能主要涉及信号受体激动剂、受体配体活性、细胞因子及其受体活性、内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性、生长因子受体结合等,见图4。

注:A:柱状图;B:气泡图。X轴表示计数或者基因比例的显著增加;Y轴代表GO功能富集分析中的“生物学过程”“细胞组分”和“分子功能”。

2.5 KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析结果显示,交集基因主要涉及糖尿病中的AGE-RAGE信号通路、流体剪切力和动脉粥样硬化、IL-17信号通路、TNF信号通路、癌症中的蛋白聚糖、前列腺癌、松弛素信号通路、膀胱癌、恰加斯病、人巨细胞病毒感染、胰腺癌、乙型肝炎、结直肠癌、类风湿性关节炎、内分泌抵抗、MAPK信号通路、Toll样信号通路、丙型肝炎、百日咳、甲型流感、肺结核、FoxO信号通路、HIF-1信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂抗性、C型凝集素受体信号传导途径通路等,见图5。

注:A:柱状图;B:气泡图。X轴表示计数或者基因比例的显著增加;Y轴表示主要的信号通路。

2.6 分子对接Autodock Vina软件对化学成分和PPI筛选出的核心靶点STAT3(PBD ID:6NUQ),JUN(PBD ID:1S9K),MAPK14(PBD ID:5LAR),MAPK1(PBD ID:2Y9Q),AKT1(PBD ID:4EKL),CTNNB1(PBD ID:1QZ7),FOS(PBD ID:1A02),IL-10(PBD ID:1ILK),IL-6(PBD ID:4CNI),TNF(PBD ID:2AZ5)进行分子对接,结合能≤5 kcal·mol-1即表明活性成分与靶点有较强的结合活性(图6)。Pymol和Discovery Studio软件将对接结果进行可视化,活性成分与作用靶点之间主要是通过氢键、π-π作用等分子作用力形成较强结合力,见图7。

图6 分子对接结合能热图

注:A:AKT1-二氢血根碱(Dihydrosanguinarine);B:TNF-荷包牡丹碱(Bicuculline);C:MAPK14-二氢血根碱(Dihydrosanguinarine);D:IL-6-西加小冠花苷(Hyrcanoside)。

2.7 各组大鼠髓核组织p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平比较与假手术组比较,模型组大鼠髓核组织p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均显著升高(P<0.05);与模型组比较,脊痛消胶囊低剂量组和高剂量组、塞来昔布组髓核组织p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平均显著降低(P<0.05),见表2、图8。

表2 各组大鼠髓核组织p-c-JUN/c-JUN、p-c-FOS/c-FOS、p-JNK/JNK、p-p38-MAPK/p38-MAPK水平

注:A:假手术组;B:模型组;C:脊痛消胶囊低剂量组;D:脊痛消胶囊低剂量组;E:塞来昔布组。

2.8 各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平比较与假手术组比较,模型组血清IL-6和 TNF-α 水平显著升高(P<0.05),IL-10水平显著降低(P<0.05);与模型组比较,脊痛消胶囊低剂量组和高剂量组、塞来昔布组血清IL-6和TNF-α水平显著降低(P<0.05),IL-10水平显著升高(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠血清IL-6、IL-10、TNF-α水平

3 讨论

LDH是引起老年人腰腿痛的常见原因,且该病的发生逐渐年轻化。肥胖[9]、吸烟[10]和缺乏运动[11]等不良生活习惯均会增加LDH的发生率。疼痛是LDH最主要的症状。LDH疼痛产生的机制主要有机械压迫机制、炎症化学刺激机制、自身免疫反应机制等[12]。本研究基于网络药理学分析脊痛消胶囊治疗LDH的作用机制,对脊痛消胶囊和LDH映射得到的分子生物学网络进行蛋白质相互作用分析发现,重要性最大的前10个靶标是STAT3、JUN、IL-6、MAPK1、FOS、CTNNB1、MAPK14、AKT1、IL-10 和TNF。进一步分析发现,分子生物学网络涉及的信号通路主要有AGE-RAGE信号通路、IL-17 信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路和Toll样信号通路等。STAT3是STAT家族之一,由770个氨基酸组成,收到激活因子如干扰素、IL-6 和IL-10后,通过Janus酪氨酸激酶和MAPKs通路二聚化并从细胞质转移到细胞核发挥调节细胞生长、凋亡和免疫应答等生物学过程[13]。研究发现,LDH会增加背根神经节神经元的兴奋性,上调RAGE和p-STAT3蛋白的表达[14],提示RAGE/STAT3信号通路的激活是LDH引发疼痛的重要机制。p38-MAPK和JNK属于MAPK信号通路的分支[15]。JNK通路是在受到感染、炎症和氧化应激等刺激后被激活的,随后磷酸化其底物JUN、FOS、ATF2和p53等,磷酸化的JUN和FOS结合形成转录因子活化蛋白1(activator protein-1,AP-1)从而调节细胞增殖、分化以及凋亡等[16]。在LDH大鼠模型中观察到p-JNK/JNK的比例显著升高[17],通过抑制JNK信号通路的激活可以显著改善LDH模型的神经根性疼痛症状[18]。p38-MAPK家族有4种同型:p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK 12)和p38δ(MAPK13),在过氧化氢诱导的人软骨终板细胞氧化应激损伤模型中,p38-MAPK信号通路被激活,p-p38-MAPK/p38-MAPK比例显著升高,提示p38-MAPK通路在腰椎间盘退变中的重要作用[19]。本研究的动物实验部分发现,在LDH模型大鼠中p-JNK/JNK、p-c-Jun/c-Jun、p-c-Fos/c-Fos、p-p38-MAPK/p38-MAPK的比例显著升高,与现有研究结果一致。

炎症反应是引发LDH疼痛的重要因素。IL是一类由白细胞产生并调节机体免疫反应的细胞因子家族,IL-6是一种炎症介质,来源于多种免疫细胞,如巨噬细胞、树突状细胞和成纤维细胞等,在炎症反应中,IL-6可以诱导其他炎症介质的产生,如IL-1和TNF-α,促进白细胞的增殖、活化,促进成纤维细胞增殖从而实现组织的修复。有研究发现,IL-6水平与患者疼痛程度呈正相关[20]。另有研究发现,较高的血清IL-6水平与患者的恢复不佳相关[21]。TNF是一种Ⅱ型跨膜蛋白,作为三聚体在质膜上表达,被TNF-α转化酶切割产生可溶性配体,通过与TNF受体1和TNF受体2结合传导信号,TNF受体1可以激活NF-κB和MAPK信号通路从而介导细胞死亡,在TNF信号通路传导中起主要作用[22]。TNF-α可以诱导髓核细胞中炎症因子IL-1β、IL-4、IL-6的产生,NF-κB和MAPK信号通路的激活,抑制该通路的激活可以使LDH模型大鼠得到保护[23]。作为一种抗炎因子,IL-10的保护作用得到了广泛研究。自体髓核突出诱导的LDH大鼠模型中,背根神经节中的IL-10水平显著下降,TNF-α水平显著升高,髓鞘内人工注射 IL-10 可以显著减轻模型大鼠的疼痛,且该效应能被TNF-α抑制,体现了两者的相互拮抗作用[24]。本研究中,脊痛消胶囊能显著降低LDH大鼠血清 IL-6 和TNF-α水平,提高IL-10的水平,说明脊痛消胶囊可以抑制炎症反应,提高LDH的抗炎能力。

LDH属中医“腰痹”“痹证”范围,根本病机为本虚标实,肾虚和风寒湿热为主要致病因素。《素问·脉要精微论》云:“腰者,肾之府,转摇不能,肾将惫矣。”肾主骨,生髓,肾虚髓海空虚,腰部的骨骼经脉得不到濡养,导致腰部疼痛,活动受限。《素问·痹论》记载:“风寒湿三气杂至,合而为痹也。其风气胜者为行痹,寒气胜者为痛痹,湿气胜者为着痹也。”LDH通常兼见“行”“痛”“着”的特点:LDH患者常常伴有下肢放射性疼痛麻木,此为“行”;在寒冷季节容易发作且疼痛剧烈,此为“痛”;发病部位较为固定,影像学研究发现,腰椎间盘突出的好发部位为L4/L5、L5/S1,占90%以上,此为“着”。《素问·痿论》曰:“宗筋者,主束骨而利机关也。”中医认为,LDH是由于“筋出槽,骨错缝”,经络相当于现代解剖学的肌腱、韧带和筋膜等组织。LDG常常伴随棘上韧带、棘间韧带和前后纵韧带等软组织的损伤,从而进一步引起椎体与椎体之间的稳定性下降,加重椎间盘的退变[25]。肝主血,在体合筋,肝血不足,血不养筋,筋脉失养,筋骨不坚,故见腰痛、膝软、胫酸、足跟痛,甚至腰脊不举、足不任身等症。LDH的常见证型可分为血瘀证、寒湿证、湿热证和肝肾亏虚证,而LDH常常是由于劳累和外伤导致气滞血瘀,经脉闭阻,不通则痛而发病,故临床以血瘀证最为多见。《血论证》云:“水病则累血,血瘀则累气。”瘀血内阻,气失宣降可导致水液停聚,瘀血与水湿相互为患,LDH导致神经根受到机械压迫压,神经根的血供障碍和水肿被认为是LDH疼痛重要机制[12]。脊痛消胶囊由白芍、车前子、川芎、泽兰、当归、杜仲、莪术、防己、黄芪、三棱、延胡索、泽泻、五灵脂和地龙等14味药组成,其中车前子、泽兰和泽泻清热利尿消肿,川芎和延胡索缓急止痛,三棱和地龙活血化瘀,白芍和当归养血舒筋,黄芪补气升阳以助行水,全方相辅相成,相得益彰,共奏益气、活血、行水之功效[4]。

综上所述,脊痛消胶囊通过抑制炎症反应和JNK/MAPK信号通路的激活从而发挥治疗LDH的效应,网络药理学分析和实验验证结果佐证了这一结论,为脊痛消胶囊的临床运用提供了一定的参考依据,也为脊痛消胶囊现代药理学的深入研究夯实了基础。