核因子红系2相关因子3高表达与胶质瘤预后及迁移能力的关系

张 燚,陈 鹏,蒋永安,蔡佳宏,卓 毅,梁家伟,袁饶饶,程世奇,张 焱

(南昌大学第二附属医院神经外科,南昌330006)

胶质瘤是最常见的颅内肿瘤,恶性程度高,术后复发率高,易对化疗产生耐药性,其年发病率为4.5/10万[1-2]。根据2007年世界卫生组织(WHO)组织病理学标准,胶质瘤可分为Ⅰ—Ⅳ级[3]。肿瘤级别越高,肿瘤的侵袭性和恶性程度越高[4]。胶质瘤的治疗方案包括手术切除、放疗和化疗[5],其预后并不令人满意[6],患者5年生存率甚至不到5%[7]。因此,为了改善胶质瘤患者的生存预后,寻找合适的筛查或监测的分子标志物迫在眉睫。

核因子红系2相关因子3(NFE2L3),又称NRF3,1999年首次被发现,是帽状“n”领(CNC)基区亮氨酸拉链家族的一员,是一种转录因子[8]。研究表明NFE2L3是胰腺癌、结直肠癌、肝癌的高危因素[9-11]。因此,NFE2L3基因可能在肿瘤中发挥关键的调节作用。然而,NFE2L3基因在胶质瘤中的作用尚不清楚,需要进一步研究。本研究采用生物信息学分析了NFE2L3的表达与胶质瘤患者预后的关系,同时用体外实验证实该基因调控胶质瘤细胞株的细胞迁移。

1 材料与方法

1.1 实验材料

U87、LN229、U251、T98人胶质瘤细胞系均购自青旗(上海)生物技术发展有限公司;Glibo DEME高糖培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司;胎牛血清购自广州赛国生物科技有限责任公司;引物序列及小干扰RNA序列(siRNA)购自通用生物(安徽)股份有限公司;Lipofectamine 3000试剂购自美国Thermo Fisher Scientific公司;RNA提取、逆转录、实时荧光定量PCR所需的试剂盒均购自宝日医生物技术(北京)有限公司;Opti-MEM减血清培养基购自美国Thermo Fisher Scientific公司;结晶紫染色液购自上海碧云天生物技术有限公司;NFE2L3抗体购自武汉博士德生物有限公司;MMP-9抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司;Tubulin抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司。实验所需的蛋白电泳仪、蛋白电泳槽、Western blot成像系统、逆转录PCR仪、-80 ℃冰箱、高速离心机、超净工作台、移液器、恒温水浴锅、液氮罐等仪器设备均来自上饶华东数字医学工程研究院。

1.2 数据集下载和生物信息学分析

从TCGA数据库(703例)和CGGA数据库(1018例)下载mRNA和临床数据。采用R软件(v4.1.1)进行KM生存分析、单因素Cox回归分析、多因素cox回归分析、ROC曲线分析、临床特征分析。通过基因表达谱交互分析(GEPIA)数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/)分析胶质瘤和正常脑组织中NFE2L3基因的表达水平。使用Human Protein Atlas(HPA)数据库(http://www.proteinatlas.org)获得NFE2L3的免疫组化数据。

1.3 细胞培养

U87、LN229、U251、T98细胞在含10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素的DMEM中,37 ℃、5% CO2、90%湿度培养箱中培养。

1.4 细胞转染

用Lipofectamine 3000结合小干扰RNA转染U251和T98细胞进行后续实验。将NFE2L3-NC转染胶质瘤细胞U251和T98的组称为对照组(NC),NFE2L3-siRNA转染胶质瘤细胞U251和T98的组称为干扰组(siRNA)。siRNA(5′-3′)序列如下:NC(正义链)UUCUCCGAACGUGUCAC-GUTT;NC(反义链)ACGUGACACGUUCGGAGAATT;siRNA(正义链)GCAGAAUGAUG-AUGAUGAATT;siRNA(反义链)UUCAUCAUCAUCAUUCUGCTT。

1.5 划痕试验

U251细胞和T98细胞分别消化后,以8×104·孔-1的密度接种于六孔板中,置于37 ℃、90%湿度、5% CO2的培养箱中过夜,次日开始转染。当细胞生长到90%时,用200 μL无菌移液管在细胞单层上作线性划痕,然后用PBS洗涤3次,去除悬浮的细胞。最后分别在0 h和48 h用显微镜观察划痕宽度并拍照,用ImageJ分析。

1.6 迁移试验

U251和T98细胞转染后,将8×104个细胞接种于200 μL的无血清培养基中,接种到Transwell室中,置于含有10%～20% FBS培养基(600 μL)的24孔板中。12～24 h后,细胞用多聚甲醛固定,结晶紫染色,镜检记录。

1.7 RNA提取和实时荧光定量PCR

按照试剂盒说明书提取转染胶质瘤细胞的RNA,将总RNA逆转录为cDNA,进行qPCR分析NFE2L3、MMP-2、MMP-9、N-cadherin、GAPDH的表达水平。

real-time PCR所用引物如下。N-cadherin:F5′-AGCCAACCTTAACTGAGGAGT-3′,R5′-G-

GCAAGTTGATTGGAGGGATG-3′;MMP-2:F5′-GATACCCCTTTGACGGTAAGGA-3′,R5′-CCTTCTCCCAAGGTCCATAGC-3′;MMP-9:F5′-GGGACGCAGACATCGTCATC-3′,R5′-TCGTCAT-CGTCGAAATGGGC-3′;GAPDH:F5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′,R5′-AAGT-GGTCGTTGAGGGCAATG-3;NFE2L3:F5′-TTCAGCCAGGCTATAAGTCAGG-3′,R5′-GC-TCAGGATTGGTGGTATGAGA-3′。

1.8 蛋白免疫印迹法

设置NC、siRNA 2组,转染U251和T98细胞后继续培养48 h,加入细胞裂解液冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r·min-1离心后保留上清,并使用BCA试剂盒进行蛋白定量,将细胞上清液 100 ℃ 高温煮沸。将提取的蛋白电泳,转膜,封闭,一抗孵育12 h,二抗孵育1～2 h。最后,利用增强化学发光(ECL)检测系统对蛋白条带进行观察。使用的主要抗体是:NFE2L3(1：1000,武汉博士德生物有限公司),MMP-9(1：1000,江苏亲科生物研究中心有限公司)和Tubulin(1：1000,武汉三鹰生物技术有限公司)。

1.9 统计学方法

采用GraphPad Prism(4.1.1)及R软件包进行分析,实验数据服从正态分布,以均数±标准差表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NFE2L3在胶质瘤中的表达水平

使用GEPIA数据库鉴定NFE2L3基因在不同肿瘤中的表达水平,发现NFE2L3在胶质母细胞瘤(GBM)中的表达水平高于非肿瘤组织(图1A)。

B:CGGA数据库中,NFE2L3在WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤的表达水平;C:TCGA数据库中,NFE2L3表达在WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤的表达水平;D—F:根据从人类基因组图谱数据库获得的免疫组织化学数据,NFE2L3蛋白在各组织中的表达情况。

通过生物信息学方法分析了CGGA和TCGA数据集,发现NFE2L3的表达水平与WHO Ⅱ—Ⅳ级胶质瘤呈正相关(图1B和1C)。根据Human Protein Atlas(HPA)数据库的免疫组化数据,与非肿瘤组织相比,胶质瘤组织中NFE2L3蛋白表达水平上调(图1D—F)。

2.2 NFE2L3与胶质瘤患者预后的关系

通过对CGGA和TCGA数据集进行KM生存分析见图2。由2A、E可见,在胶质瘤患者中NFE2L3表达水平越高,患者预后越差。通过CGGA和TCGA数据库中的单变量Cox和多变量Cox分析发现,NFE2L3是一个高风险指标(图2B、C、F、G)。ROC曲线分析显示,NFE2L3可作为预测1、3和5年总生存的生物标志物,基于CGGA数据集,其AUC值分别为0.718、0.760和0.772(图2D)。基于TCGA数据集进行了同样的分析,AUC值分别为0.806、0.823和0.787(图2H)。

A:CGGA数据库中NFE2L3高表达组和低表达组的总生存率;B:CGGA数据库中NFE2L3的单变量Cox分析;C:CGGA数据库中NFE2L3的多变量Cox分析;D:CGGA数据集中NFE2L3的ROC曲线分析;E:TCGA数据库中NFE2L3高表达组和低表达组的总生存率;F:TCGA数据库中NFE2L3的单变量Cox分析;G:TCGA数据库中NFE2L3的多变量Cox分析;H:TCGA数据集中NFE2L3的ROC曲线分析。

2.3 胶质瘤患者NFE2L3表达与临床特征的相关性

通过分析来自CGGA数据库和TCGA数据库的胶质瘤数据发现,在CGGA数据库中NFE2L3的表达水平与年龄(P<0.001)、1p19q编码缺失状态(P<0.001)、IDH突变状态(P<0.001)、化疗状态(P<0.001)和组织学类型(P<0.001)密切相关(图3a—e);在TCGA数据库中,NFE2L3的表达水平与年龄(P<0.001)、1p19q编码缺失状态(P<0.001)、IDH突变状态(P<0.001)密切相关(图3f—h)。

a—e:数据来自CGGA数据库;f—h:数据来自TCGA数据库。A:星形细胞瘤;AA:间变性星形细胞瘤;AO:间变性少突胶质瘤;GBM:胶质母细胞瘤;O:少突神经胶质瘤;rA:复发星形细胞瘤;rAA:复发间变性星形细胞瘤;rAO:间变性少突胶质瘤复发;rGBM:复发胶质母细胞瘤;rO:复发少突胶质瘤;sGBM:继发性复发胶质母细胞瘤。

2.4 敲低NFE2L3基因后胶质瘤细胞迁移能力的变化

为了评估NFE2L3在胶质瘤中的生物学功能,本研究根据qPCR的结果选择了胶质瘤细胞系中高表达的U251和T98细胞进行后续实验(图4A)。用NFE2L3-NC和NFE2L3-siRNA分别转染胶质瘤细胞U251和T98,并检测NC和siRNA的敲低效率,发现在mRNA水平和蛋白水平上U251细胞和T98细胞中的siRNA组敲低效率非常高(图4B—C)。Transwell迁移实验和细胞划痕实验结果显示,在U251细胞和T98细胞中的干扰组(siRNA)的迁移能力明显低于NC(图5A—C)。同样,在U251细胞和T98细胞中的siRNA中的MMP-9在mRNA和蛋白水平上的表达低于NC(图6A—B)。

A:胶质瘤细胞系(U87,LN229,T98,U251)中NFE2L3的mRNA表达水平;B:U251和T98细胞中干扰组(siRNA)和对照组(NC)中NFE2L3的mRNA表达水平;C:U251和T98细胞、siRNA和NC中NFE2L3的蛋白表达水平。*P<0.05,**P<0.01。

A:Transwell迁移实验(胶质瘤细胞系U251和T98),siRNA vs NC;B—C:在0 h和48 h,U251和T98胶质瘤细胞系的划痕实验,siRNA vs NC。*P<0.01,**P<0.001,***P<0.000 1。

A:qPCR验证NFE2L3敲低后MMP-9的mRNA表达水平;B:WB证实敲低NFE2L3后MMP-9的蛋白表达水平。ns:P>0.05,*P<0.05,**P<0.01。

3 讨论

神经胶质瘤是起源于神经胶质祖细胞的肿瘤[12-13],是严重影响人类健康的致命性疾病之一。除了替莫唑胺外,在改善脑胶质瘤患者预后方面还未取得重大突破[14-15]。胶质瘤越恶性,预后越差。因此,探索基因在胶质瘤发生发展中的作用,对明确胶质瘤的治疗靶点有很大帮助[16]。CNC家族成员与肿瘤的发生发展密切相关[17]。因此,CNC家族成员作为癌症治疗的重要靶点受到广泛关注。NFE2L3属于包含NFE2L1和NFE2L2的CNC家族。广泛的生化研究阐明了NFE2L3的一部分调节机制。在生理条件下,NFE2L3的转录活性受其在内质网(ER)中的螯合抑制,从而阻止其不必要的基因表达[18]。在暴露于尚未鉴定的应激和/或信号时,NFE2L3易位至细胞核并通过抗氧化应答元件(ARE)或Maf识别元件(MARE)通过与小Maf蛋白的异二聚化发挥其转录活性。这些观察结果意味着NFE2L3在响应某些激活信号时起到诱导型转录因子的作用。NFE2L3在霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、大肠癌、睾丸癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中均发现NFE2L3呈现显著高表达水平,但有关该基因到底扮演着促癌基因还是抑癌基因的角色却存在着不同的研究发现。例如,CHEVILLARD等[19]最早利用NFE2L3基因缺陷的小鼠模型发现,该基因缺失后的小鼠的T细胞淋巴母细胞淋巴瘤的发病率显著升高,且死亡亦增加,提示该基因在造血系统恶性肿瘤中具有保护作用,发挥着抑癌基因的角色。另一方面,WANG等[9]证实NFE2L3在胰腺癌中呈明显高表达,且高表达NFE2L3的患者生存期更短,其机制与其调控VEGFA表达促进肿瘤血管生成有关,该结果提示NFE2L3又具有促癌基因的角色。NFE2L3促进恶性肿瘤的转移和血管生成[20],然而,NFE2L3在胶质瘤的机制仍不明确。有必要在胶质瘤中进行了NFE2L3的探索。

结合GEPIA数据库和HPA数据库中NFE2L3在胶质瘤中不同维度的表达情况可知NFE2L3在胶质瘤中可能是高度表达,通过获取的TCGA和CGGA数据库中的数据,结合KM曲线分析、单变量和多变量Cox分析、ROC曲线分析表明NFE2L3表达越高,患者预后越差。此外,NFE2L3的表达水平与患者年龄、组织学类型、化疗状态、1p19q编码缺失状态、IDH相关突变状态密切相关。因此,通过生物信息学角度分析出NFE2L3在胶质瘤是高表达的,并且可能作为独立预后标志物。但生物信息学的分析只能提供参考证据,并不能得出确定的结论,因此需要进一步的实验去探索其生物调控机制。

肿瘤细胞的侵袭与迁移是决定肿瘤细胞转移能力的两个重要因素。局部侵袭性生长的特性往往是胶质瘤难以根治和复发的根本原因,也是直接导致肿瘤难以全切、术后复发率高、预后差的主要原因。因此,有关胶质瘤的抗侵袭迁移治疗具有重要的研究意义。为了确定NFE2L3在胶质瘤细胞中的生物学作用,通过划痕实验、Transwell迁移、qPCR和Western blotting实验发现敲低NFE2L3可以抑制U251和T98细胞的迁移。在胃癌、甲状腺癌和肝细胞癌中也发现了NFE2L3敲除后迁移能力的降低[21-23]。通过实时荧光定量PCR和Western blot验证了在U251和T98细胞中敲低NFE2L3后,MMP-9的mRNA表达水平和蛋白表达水平都出现了明显降低。鉴于MMP-9作为基质金属蛋白酶家族的成员之一,参与肿瘤侵袭转移,这也说明了NFE2L3可能参与胶质瘤细胞的迁移。

总之,NFE2L3分子可能作为胶质瘤独立预后标志物,并且这一机制可能由迁移介导。