香菇多糖通过细胞凋亡和细胞周期阻滞增强食管癌细胞的放射敏感性

赵桂芳,吴 琛

(1.江西省人民医院,南昌医学院第一附属医院肿瘤科; 2.南昌大学第二附属医院眼科,南昌 330006)

全球食管癌每年新发病例为60多万例[1],而我国食管癌每年新发为30多万例,占全球年新发病例数的一半[2]。我国食管癌居国内恶性肿瘤发病率的第4位,病死率的第6位,即使是早期可行手术治疗的患者,其5年生存率仅约10%～25%,预后非常差[3-4]。临床上约80%的食管癌患者处于中晚期,治疗手段非常有限。目前放疗是食管癌的重要治疗手段,但放射抗拒是临床治疗中最常见的问题。放射抗拒导致放疗后肿瘤局部复发仍是目前影响食管癌患者生存的重要因素。

临床上常用化疗药物来增强食管癌的放疗敏感性,但这类药物对食管癌患者总生存时间的改善已处于瓶颈期,因此寻找新的放疗增敏剂来提高肿瘤患者的生存率显得尤为必要。有研究[5]表明,药食同源的香菇多糖(Lentinan,LNT)对乳腺癌、肺癌、消化道肿瘤等多种肿瘤及恶性胸腹腔积液均具有抑制作用,其主要抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移及血管生成等。既往有临床研究[6]证实LNT能增加食管癌患者的放疗疗效,但其机制尚不清楚。故本研究旨在观察LNT对人食管癌细胞Eca109的放疗增敏作用,并初步探讨其放疗增敏的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

人食管癌Eca109细胞株由华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心赠送。

LNT(规格2 mL：1 mg)购自金陵药业股份有限公司;RPMI-1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司;青链霉素购于美国Hyclone公司;MTT试剂购自美国Biosharp公司;Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒购自美国BD公司;碘化丙啶(PI)试剂购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将人食管癌细胞Eca109复苏后,用含有RPMI-1640培养基培养,放置于37 ℃、5%CO2的培养箱中,待细胞长至80%～90%时,用0.25%的胰酶消化后传代。取对数期生长的Eca109细胞用于后续实验。

1.2.2 MTT试验

将Eca109细胞接种于96孔板中,贴壁后分别加入不同质量浓度(0、6.125、12.5、25.、50、100、200、400、800 μg·mL-1)LNT处理24 h,然后用MTT溶液避光孵育4 h后每孔加入DMSO溶解振荡,待其混合均匀后用酶标仪在490 nm波长条件下测定各孔的吸光度(OD)值。抑制率(IR)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。实验重复3次。根据各组抑制率筛选LNT后续质量浓度。

1.2.3 克隆形成实验

实验分为2组:LNT+放疗组、单纯放疗组。取对数期生长的Eca109细胞,将细胞悬液充分混匀后接种到6孔板中,LNT+放疗组用200 μg·mL-1LNT作用24 h后予以不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)放疗,单纯放疗组仅予以不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)放疗。培养细胞定期换液,于37 ℃培养箱中连续培养7～14 d后予以甲醇固定,结晶紫染色,计数2组形成的克隆球数(50个以上细胞形成的细胞团为1个克隆球)。计算细胞的集落形成率(PE):PE=单纯放疗组克隆球形成数/单纯放疗组接种细胞数×100%。利用PE计算细胞存活分数(SF):SF=LNT+放疗组克隆形成数/LNT+放疗组接种细胞数×集落形成率。采用SigmaPlot软件拟合细胞存活曲线。采用简单多靶单击模型计算放射敏感性相关参数放射增敏比(SER),分析LNT对Eca109细胞放疗敏感性的影响并筛选后续放疗剂量。

1.2.4 流式细胞术测细胞凋亡和细胞周期

实验分为4组:对照组、LNT组、单纯放疗组、LNT+放疗组,其中LNT质量浓度为200 μg·mL-1,放疗剂量为2 Gy。取对数期生长的Eca109细胞,将细胞悬液充分混匀后接入6孔板中,4组细胞均处理24 h。细胞凋亡实验用5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色,室温下放置15 min后流式细胞仪上机检测,计算各组细胞凋亡率。细胞周期实验用乙醇固定各组细胞、RNA酶溶解、水浴、PI染色后,流式细胞仪上机检测,统计并分析各组在G1、S、G2/M期的分布情况。

1.2.5 统计学方法

采用GraphPad Prism 5.0软件、Photoshop软件、SPSS 22.0软件分别对实验图像和实验数据进行处理。计量资料以均数±标准差表示;2组间比较采用独立样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LNT对人食管癌Eca109细胞增殖的影响

MTT结果显示,与0 μg·mL-1LNT组比较,随着LNT质量浓度的增加,其对Eca109细胞的抑制率增高(均P<0.05)。见图1。后续实验选取200 μg·mL-1为LNT的质量浓度。

LNT/(μg·mL-1)#P<0.05,*P<0.01与0 μg·mL-1LNT组比较。图1 不同质量浓度LNT对食管癌细胞Eca109增殖的影响

2.2 LNT对Eca109细胞的放疗增敏作用

与单纯放疗组比较,LNT+放疗组的SF显著降低,放疗增敏比SER为1.27。见图2。后续实验选择2 Gy为放疗的剂量。

2.3 LNT联合放疗对Eca109细胞凋亡的影响

流式细胞术结果显示,对照组、LNT组、单纯放疗组、LNT+放疗组的细胞凋亡率分别为(4.82±1.42)%、(32.21±1.90)%、(14.14±3.07)%和(55.58±1.87)%。与其他3组比较,LNT+放疗组的细胞凋亡率更高(t=37.301、15.13、19.937,均P<0.01)。见图3—4。

2.4 LNT联合放疗对Eca109细胞周期的影响

流式细胞术结果显示,对照组、LNT组、单纯放疗组、LNT+放疗组的G2/M期的比例分别为(12.55±1.18)%、(20.91±1.38)%、(38.96±1.53)%、(48.86±3.94)%。与其他3组比较,LNT+放疗组G2/M期比例更高(t=15.256、11.572、4.049,均P<0.01)。见图5—6。

图5 各组细胞周期分布情况(流式细胞术)

*P<0.01。图6 各组细胞周期的分布

3 讨论

我国食管癌常见的病理类型是鳞癌和腺癌,其中鳞癌占90%以上,恶性程度高,预后差[7]。为延长患者的生存时间,降低局部复发率,临床多采用手术、放疗、化疗、靶向及免疫等综合治疗手段,其中放疗可显著降低食管癌的复发率[8],因此如何提高食管癌患者的放疗敏感性是延长患者生存时间的关键。临床上,以铂类、紫杉类、氟尿嘧啶类为代表的化疗药物是目前用于增强食管癌放疗敏感性的常见药物[9],但疗效仍不理想,而且这类药物存在严重的不良反应,甚至部分患者因不良反应太大而未能继续放疗。

LNT是从香菇中提取的一种天然生物活性纯化多糖,安全性高[10]。临床研究[11]表明LNT具有免疫调节、促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长等作用。动物研究[12]发现LNT联合AdIRF3可通过刺激INF-β的表达而抑制小鼠乳腺癌的生长。另有研究[13]采用LNT处理人结直肠癌SW837细胞,发现LNT呈浓度依赖性抑制SW837细胞的增殖,同时CD155、CD80、CD47、HSP70、HSP90等免疫相关分子的表达水平升高。同步放化疗联合LNT治疗非小细胞肺癌脑转移也发现,该治疗可延长患者生存时间,提高其生存率及局部控制率[14]。本课题组[15]在临床工作中发现使用LNT的食管癌患者,肿瘤明显缩小,且放疗相关的不良反应发生率低。本研究发现LNT呈浓度依赖性抑制人食管癌细胞Eca109的生长,且能显著增加人食管癌细胞Eca109的放疗敏感性。

王嵘等[16]研究发现,LNT的放疗增敏作用机制可能与诱导细胞周期阻滞和激活ERK1/2信号通路有关。细胞周期分为G0、G1、S和G2/M期,其中G2/M期细胞对放疗最敏感。故细胞周期阻滞在G2/M期是增强放疗敏感性的标志之一。本研究发现,LNT+放疗组细胞周期阻滞在G2/M期的比例最高,表明LNT联合放疗可能通过将细胞周期阻滞在G2/M期实现放疗增敏。另有研究[17]显示,LNT通过下调凋亡抑制蛋白survivin的表达,进而促进人胰腺癌细胞ASPC-1的凋亡。本研究结果显示,LNT+放疗组的Eca109细胞凋亡率明显增强,提示LNT的放疗增敏作用是通过促进细胞凋亡实现的。

综上,本研究在细胞水平证实LNT对食管癌具有放疗增敏作用,其机制可能是通过诱导细胞凋亡和G2/M期细胞周期阻滞来实现的。但介导LNT放疗增敏的信号通路尚不清楚,有待后续深入研究。