人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所，沈阳 110001）

人皮肤成纤维细胞原代培养及生物学特性

王晓华，王扬，蒋涛，付立业，姜又红

（中国医科大学 附属第一医院肿瘤研究所，沈阳 110001）

目的 探索和建立人皮肤成纤维细胞原代培养的方法，为皮肤成纤维细胞在临床医学中的应用提供可靠的科学依据。方法 胰蛋白酶消化法分离培养人皮肤成纤维细胞；细胞生长曲线及MTT法测定细胞增殖能力；流式细胞仪测定细胞生长周期及细胞增殖指数；倒置显微镜下观察成纤维细胞生长状态；HE染色观察细胞爬片下的形态及着色；免疫组织化学染色观察成纤维细胞中间丝波形蛋白；电子显微镜下观察成纤维细胞超微结构。结果 体外用胰蛋白酶消化法建立了人皮肤成纤维细胞；传5代内细胞及传5代内冻存复苏后人皮肤成纤维细胞增殖能力均很强；倒置镜下观察、HE染色、波形蛋白免疫组化染色及电镜下观察鉴定培养细胞的形态及生物学特性符合成纤维细胞。结论 本研究确立了体外人皮肤成纤维细胞原代培养。

人；皮肤；原代培养；成纤维细胞；细胞增殖指数；细胞形态学

随着年龄的增长，皮肤会出现松弛、干燥粗糙、弹性下降、皱纹增多等老化现象，这些现象都与成纤维细胞数量减少以及分泌合成功能下降或异常有关［1］。人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮网织层中最重要的细胞，是皮肤衰老和细胞受损后的主要修复细胞之一［2］。它不但能够促进表皮细胞的迁移、增殖和分化，还能分泌大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，具有强大的自我更新能力［3］，从而修复老化的皮肤。成纤维细胞是维持皮肤弹性和韧性的重要细胞［4］，因其特有的生物学特性，在抗皮肤衰老中起着重要的作用。本研究拟通过皮肤成纤维细胞的分离和体外培养，观察、总结体外培养的成纤维细胞生物学特性，在细胞水平上对皮肤成纤维细胞的形态及生物学特性进行研究，以获得在体外稳定生长的皮肤成纤维细胞，为成纤维细胞在医学美容除皱术中的应用提供可靠的科学依据［5］。

1 材料与方法

1.1 材料

皮肤标本为儿童阴茎环切包皮2块，由中国医科大学附属第一医院泌尿科提供。DMEM/F12培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、碘化丙锭、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、3，3′-二氨基联苯胺（DAB），美国 Sigma公司产品；Ⅱ型胶原酶，美国Worthington公司产品；RNA酶，德国AppliChem公司产品；波形蛋白抗体，丹麦Dako公司产品；CO2培养箱（MLO-20AIC），日本Sanyo公司产品；倒置显微镜（Imt-413），日本Olympus公司产品；酶标分析仪RT6000，美国雷杜公司产品；流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司产品；透射电镜（TEM-1200，1011EX），中国医科大学电镜室提供。

1.2 方法

1.2.1 原代细胞培养：阴茎环切包皮2块，每块约2cm×3cm，将组织反复用含抗菌素的PBS漂洗，去除脂肪和结缔组织及皮下血管，将组织剪成0.5cm×1.5cm的皮条，放入离心管，加2mg/ml的Ⅱ型胶原酶消化液，4℃过夜，去表皮，分离真皮，加0.25%胰蛋白酶反复吹打消化，用含血清的DMEM/F12培养基清洗，离心 1200r/min，8min，弃上清，按 1×105/ml细胞浓度加10%牛血清DMEM/F12培养液培养。待细胞贴壁，据细胞生长情况传代和换液。

1.2.2 测定细胞生长曲线：分别将培养第2代和第5代的成纤维细胞消化，调节细胞浓度为2×104/ml，接种于24孔培养板，每孔接种1ml，培养箱内培养，每隔24h收集3孔细胞并计数，取平均值，连续计数7d后绘制生长曲线。

1.2.3 测定冻存细胞生长曲线：分别将培养第2代和第5代成纤维细胞常规冻存于液氮，4周后复苏，调节细胞浓度为2×104/ml，接种于24孔培养板，每孔1ml，培养箱内培养，每隔24h收集3孔细胞并计数，取平均值，连续计数7d后绘制生长曲线。

1.2.4 MTT法测定细胞的增殖能力：取对数生长期的成纤维细胞消化稀释，调节细胞浓度为2×104/ml。接种于96孔培养板，每孔加100μl细胞悬液。分设原代培养第2代、第5代细胞和冻存复苏后的第2代、第5代细胞4组，对照组选择了正常人胚肺成纤维细胞，每组设5个重复孔，培养箱内培养72h后加MTT。4h后终止培养，每孔加入二甲基亚砜150ml溶解，振荡10min，波长选570nm，参考波长选490nm，用酶联免疫检测仪测定各孔光密度（optical density，OD）值，测定细胞的增殖能力。

1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期：分别取对数生长期的原代培养第2代、第5代以及冻存复苏后的第2代和第5代成纤维细胞，对照组选择正常人胚肺成纤维细胞。常规消化，用冷PBS清洗，1500r/min离心8min。弃上清液，加2.5ml冷PBS溶液重悬细胞，然后缓慢加入-20℃预冷的95%乙醇7.5ml，乙醇的终浓度为75%，冰浴4h固定；2000r/min离心8min，去除乙醇固定溶液。用适量1%血清PBS将其移入1.5ml的尖底离心管内，1000r/min离心8min。弃上清液，加 50μg/ml的 RNA酶溶液 100μl，37℃培养箱内30min，然后冰浴终止酶作用。加等量50μg/ml碘化丙锭应用液。4℃闭光染色30min，流式细胞仪上检测细胞周期。

1.2.6 倒置显微镜下观察细胞形态：培养48h后，倒置显微镜下定期观察细胞，记录照相。

1.2.7 HE染色：收集培养第3代的成纤维细胞以2×105/ml密度行细胞爬片，24h后终止培养，PBS充分漂洗细胞，常规HE染色，中性树胶封片备用。

1.2.8 免疫组织化学染色检测波形蛋白：细胞以2×105/ml密度行细胞爬片，于培养箱内培养，待细胞爬满玻片的40%～60%时，取出玻片，PBS漂洗，3%的过氧化氢室温孵育5min，PBS漂洗，滴加即用型鼠抗人波形蛋白一抗，置4℃冰箱过夜；PBS漂洗后加入羊抗鼠辣根过氧化物酶标记的二抗，室温30min；PBS漂洗后DAB显色1min，苏木素复染。备用。

1.2.9 成纤维细胞超微结构观察：取对数生长期第3代成纤维细胞，扩大培养，收集细胞总量在2×1010，PBS清洗1000r/min离心8min，再用1∶1的PBS与2.5%戊二醛固定液，1000r/min离心8min，弃上清，沉淀细胞，再用PBS配制2.5%的戊二醛固定2h，经脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色备用。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 生长曲线测定结果

成纤维细胞的倍增时间较短，生长曲线中，在一段时间内细胞数量与时间呈正相关，0～1d为潜伏期、1～3d为细胞增殖期、3～5d为对数生长期、5～7d为平台期，传代后的成纤维细胞增殖能力与原代细胞比较显示出同样的增殖能力，冻存复苏后的成纤维细胞虽受到复苏成活率的影响在潜伏期内有负增殖，但在第2天后仍表现出很强的增殖能力。原代培养第2代和第5代细胞的增殖能力与冻存复苏后的同代次细胞比较也无明显差异。见图1。

2.2 MTT检测结果

人皮肤成纤维细胞的增殖能力很强。MTT检测原代培养第2代、第5代以及冻存复苏后的同代次细胞的活细胞染色的平均OD值分别为1.086±0.022、1.097±0.025、1.018±0.018和 1.035±0.020，与对照组人胚肺成纤维细胞的平均OD值（0.435±0.024）比较差异均有统计学意义（P<0.05），表明人皮肤成纤维细胞的增殖能力较人胚肺成纤维细胞强。原代培养第2代与第5代成纤维细胞比较OD值无统计学差异，且与它们冻存复苏后的同代次细胞比较OD值也没有统计学差异。

图1 人皮肤成纤维细胞生长曲线Fig.1 Growth curve of human skin fibroblasts

2.3 流式细胞仪测定结果

成纤维细胞周期S期细胞百分比和增殖指数（proliferative index，PI）可反映细胞增殖活力的高低。不同代次成纤维细胞以及它们冻存复苏后的细胞生长周期见表1。原代培养第2代、第5代及复苏后第2代、第5代S期细胞百分比和PI值各实验组间比较无统计学差异；对照组S期细胞百分比和PI值相对较低，各实验组与对照组比较均有统计学差异（P<0.05）。见表 1。

表1 成纤维细胞细胞周期和增殖指数（±s，n=5）Tab.1 Cell cycle and proliferative index of fibroblasts（x ±s，n=5）

表1 成纤维细胞细胞周期和增殖指数（±s，n=5）Tab.1 Cell cycle and proliferative index of fibroblasts（x ±s，n=5）

1）P<0.05vs control group.

Group G0/G1（%） S（%） G2/M（%） PI（%）The second passage of primary culture 24.10±1.02 46.28±0.981） 29.20±1.45 75.48±0.741）The fifth passage of primary culture 22.38±0.73 49.33±1.211） 28.29±0.88 77.62±0.641）The second passage after cryopreservation 27.38±0.73 46.40±0.661） 26.22±0.91 72.62±1.071）The fifth passage after cryopreservation 28.12±1.27 43.56±1.101） 28.31±0.65 71.88±0.861）Control 49.78±0.49 32.33±0.71 17.89±1.01 50.22±0.55

2.4 倒置显微镜下成纤维细胞形态

原代培养的人皮肤成纤维细胞接种3～5d时就开始贴壁，5～7d时细胞开始生长繁殖，7～9d后繁殖旺盛，相互融合成片。倒置镜下见细胞大多呈长梭形、扁平星形，部分呈三角形，原代中的细胞有许多没有伸展的圆型细胞。细胞在生长旺盛时代谢物增多，在倒置显微镜下细胞排列成簇状。见图2。

图2 倒置镜下观察成纤维细胞形态 ×20Fig.2 Morphology of fibroblasts observed under inverted microscope×20

2.5 HE染色细胞形态学观察

光镜下观察，细胞为多角形或长梭形，核较大，胞质较多，细胞核圆形或椭圆形，单核。胞核着淡蓝紫色，胞质着粉红色。见图3。

2.6 免疫组织化学检测波形蛋白

波形蛋白组化染色显示，成纤维细胞胞质内有棕黄颗粒或胞质着棕黄色，胞核不着色，见图4。

2.7 成纤维细胞超微结构观察

图3 成纤维细胞HE染色 ×20Fig.3 HEstaining of fibroblasts×20

图4 成纤维细胞波形蛋白免疫组织化学染色 ×20Fig.4 Immunohistochemical staining of vimentin in fibroblasts×20

透射电镜下见成纤维细胞与纤维细胞比较核增大，细胞核/质比例减小，细胞核固缩，核仁大、明显，染色质凝集，胞质内有丰富的粗面内质网，有的内质网逐渐扩张，排列无序。见图5。

3 讨论

图5 透射电镜下成纤维细胞的超微结构 ×6000Fig.5 Ultrastructure of fibroblasts obseved under transmission electron microscope×6000

皮肤为人体最大的器官，成纤维细胞是皮肤真皮层中主要细胞，而且是人体最容易获得的体细胞［6］。由于人皮肤成纤维细胞比较容易获取，所以小面积皮肤即可获得较多的原代细胞，通过传代可得到高纯度的成纤维细胞。生长曲线中，在一定时间内，细胞数量随时间的增加而呈正增殖状态，0～1d为潜伏期、1～3d为细胞增殖期、3～5d为对数生长期、5～7d为平台期，传代后的细胞增殖能力与原代细胞比较显示出同样的增殖能力，冻存复苏后的细胞虽受到复苏成活率的影响在潜伏期内有负增殖，但在有限的传代次数内仍表现出很强的增殖能力。

MTT法检测的是活细胞的数量及细胞的增殖能力，死细胞不发生反应，可观察到细胞生长活力和增殖数量，OD值高，表明活细胞数量高，细胞增殖能力强。不同代次及冻存复苏后的人皮肤成纤维细胞增殖能力都很强，与细胞生长曲线的结果一致。表明成纤维细胞的倍增时间较短，在体外扩增速度快，拥有较强的分化潜力，这是皮肤成纤维细胞可作为靶细胞进行多种治疗的最重要的条件。

细胞周期由G1期进入S期，存在一个特殊的G1/S限制点，一旦越过限制点就进入S期而处于增殖分裂状态［7］。细胞是否能通过限制点受一系列特异或非特异的因素的影响。其中G1期细胞百分比的减少、S期细胞百分比增加，提示细胞从G1期向S期转化，PI值增高，细胞增殖活性强。本研究结果显示，不同代次成纤维细胞以及它们冻存复苏后，细胞都能顺利通过G1/S限制点而进入S期，S期细胞百分比相对较高，PI值就高，说明处于增殖分裂状态的细胞比例较高，细胞增殖能力强。这样的增殖能力对皮肤衰老细胞及创伤的修复起着决定的作用。

体外培养的成纤维细胞具有稳定的生物学特性。它的形态多样是依其细胞的生物学特性及功能变化而不同的，多呈大多角形和扁平星形，粗面内质网和线粒体均发达，合成胶原蛋白的功能较强，是由胚胎时期的间充质细胞分化而来的［8］。波形蛋白就存在于间充质细胞中，是鉴定成纤维细胞的一个很好的指标。成纤维细胞的结构蛋白波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白，也不同于肌细胞的桥连蛋白，成为成纤维细胞鉴定的特异性的标志［9］。

成纤维细胞能分泌和合成胶原蛋白、弹性蛋白及多种细胞修复因子［10］，其中最主要的功能是合成胶原蛋白。而胶原蛋白是维持皮肤与肌肉弹性的主要成分。在皮肤衰老和创伤修复的过程中生长因子可刺激成纤维细胞经过细胞内合成、细胞外沉淀和分解再吸收等一系列动态过程完成胶原蛋白的合成。在这一过程中，成纤维细胞的内部结构及功能发生改变，主要是细胞核和核仁变肥大，粗面内质网增生，从而获得大量合成胶原蛋白的能力。而成纤维细胞正是在粗面内质网内合成前胶原的，其中脯氨酸及赖氨酸经内质网中的脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶催化，形成羟脯氨酰和羟赖氨酰，它们是胶原蛋白的重要组成部分。

人体皮肤衰老和创伤修复是一个复杂的生物学过程。成纤维细胞是这一生物过程中的主要修复细胞之一，而且是未来最有希望的基因治疗细胞之一。

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（编辑 陈 姜，英文编辑 陈 姜）

Primary Culture and Biological Characteristics of Human Skin Fibroblasts

WANGXiao-hua，WANGYang，JIANGTao，FULi-ye，JIANGYou-hong
（Cancer Research Institute，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo establish a method for primary culture of human skin fibroblasts and to provide a reliable basis for clinical application of skin fibroblasts.MethodsHuman skin fibroblasts were cultured with trypsin digestion.The proliferation of fibroblasts was detected by growth curve and MTTassay.The cell cycle and proliferation index were determined by flow cytometry.The morphology and ultratructure of the fibroblasts was observed under inverted and electron microscope，respectively.Immunohistochemical staining was performed to observe the vimentin in fibroblasts.ResultsHuman skin fibroblasts were obtained.The proliferative ability of the fibroblasts was high within 5passages or after cryopreservation.The morphology and biological characteristics of fibroblasts were confirmed under inverted and electron microscope and by HEand immunohistochemical staining.ConclusionThe method for primary culture of human skin fibroblasts in vitro is successfully established.

human；skin；primary culture；fibroblast；cell proliferation index；cell morphology

R318.08

A

0258-4646（2010）12-1041-04

辽宁省科学技术基金资助项目（2008225010-12）

王晓华（1958-），女，副主任技师，本科.E-mail：just_wxh@hotmail.com

2010-08-31

·短篇论著·