乳腺癌Ki-67和p53表达分析及其意义

贾实，张文海，李建一，张扬

（中国医科大学 附属盛京医院乳腺外科，沈阳 110004）

乳腺癌Ki-67和p53表达分析及其意义

贾实，张文海，李建一，张扬

（中国医科大学 附属盛京医院乳腺外科，沈阳 110004）

目的 分析研究Ki-67和p53在雌激素受体（ER），孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（c-erbB-2）受体均为阴性的乳腺癌中的表达、与临床分期的关系及其临床意义。方法 选取原发性乳腺癌184例，采用免疫组化法分析Ki-67和p53的表达。χ2检验进行统计学分析。结果Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌中Ki-67表达率为29.1%，p53表达率为25.9%；而Ⅲ期和Ⅳ期中Ki-67的表达为61.5%，p53的表达率为46.1%；2组比较，Ki-67、p53蛋白表达率差异有统计学意义（P<0.05）。ER、PR以及c-erbB-2受体均为阴性的乳腺癌中Ki-67的表达率为48.3%，p53阳性表达率为58.1%，而非此类型的乳腺癌组中Ki-67的表达率为30.1%，p53的阳性表达率为22.9%，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 Ki-67和p53蛋白表达与乳腺癌的临床分期密切相关，提示Ki-67及p53的蛋白过度表达的乳腺癌预后不良；Ki-67和p53在ER、PR以及c-erbB-2受体均为阴性的乳腺癌中过表达，解释了此类乳腺癌的临床高侵袭性的生物学特性。

p53；Ki-67；乳腺癌；免疫组织化学

三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是指雌激素受体（estrogen receptor，ER），孕激素受体（progestogerone receptor，PR），和人表皮生长因子受体2（c-erbB-2）表达均呈阴性的乳腺癌，约占全部乳腺癌的15%［1］，临床表现呈高度侵袭性，目前缺乏有效的靶向治疗药物。因此研究三阴性乳腺癌的分子生物学特征对于判断肿瘤预后、制定临床化疗方案，以及寻找靶向治疗的方法有着重要的意义。本研究通过检测乳腺癌Ki-67及p53表达，分析其在不同时期及类型的乳腺癌中表达差异，探讨其潜在的临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2004年7月至2008年9月中国医科大学附属盛京医院乳腺外科手术切除并经病理证实的乳腺浸润性导管癌184例，患者均为女性，年龄29～68岁，平均46.1岁，其中三阴性乳腺癌31例（均经外院病理会诊再次证实），非三阴性乳腺癌153例，术前均未进行新辅助治疗。184例乳腺癌中早期乳腺癌组158例（Ⅰ期乳腺癌63例，Ⅱ期乳腺癌95例），晚期乳腺癌组26例（Ⅲ期乳腺癌24例，Ⅳ期乳腺癌2例）。

1.2 方法

肿瘤标本均用10%中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，4μm厚切片，采用HE染色及SP染色，经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水，组织抗原微波修复。滴加一抗后4℃冰箱孵育过夜；滴加二抗，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素，室温孵育20min。各步骤间以PBS冲洗5min，连续3次。DAB显色，苏木精复染。已知p53、Ki-67阳性切片为阳性对照，以PBS液代替一抗为阴性对照。鼠抗人Ki-67核抗原单克隆抗体，兔抗人p53抗体、免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 结果判定

（1）ER、PR癌细胞核棕黄色着色<10%为阴性表达，c-erbB-2细胞膜棕黄色着色<10%为阴性表达；（2）Ki-67阳性表达，以细胞核内棕色颗粒为阳性，每例观察10个高倍视野，每个视野记数100个细胞，计算Ki-67阳性细胞数占细胞总数的比例，+：5%～25%，2+：25%～50%，3+：50%～75%，4+：75%～100%；（3）p53蛋白：细胞核内棕色颗粒为阳性，每张切片检测10个视野（×400），阳性细胞<10%为阴性，阳性细胞≥10%为阳性。

1.4 统计学处理

采用SPSS11.5软件进行统计学处理，比较用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组织化学特征

Ki-67表达于乳腺癌细胞中的细胞核，呈棕黄色到深棕黄色（图1A）；p53表达于乳腺癌组织中的细胞核，可见散在分布于细胞核内棕黄色染色（图1B）；阴性对照，可见肿瘤细胞核较大但其中无棕黄色染色。

图1 Ki-67和p53阳性表达 ×400Fig.1 Positive expressions of Ki-67and p53×400

2.2 Ki-67与p53表达分析

Ⅰ期和Ⅱ期乳腺癌中Ki-67表达率为29.1%，p53表达率为25.9%；而Ⅲ期和Ⅳ期中的Ki-67的表达为61.5%，p53的表达率为46.1%；两组Ki-67、p53蛋白表达率差异有统计学意义（P<0.05）。ER、PR以及c-erbB-2受体均为阴性的乳腺癌中Ki-67的表达率为48.3%，p53的阳性表达率为58.1%，而非此类型的乳腺癌组中Ki-67的表达率为30.1%，p53的阳性表达率为22.9%，差异有统计学意义（P<0.05）。

表1 Ki-67及p53在不同临床分期中的表达情况Tab.1 Expressions of Ki-67and p53in different clinical stages of breast cancer

Ki-67及p53的表达与乳腺癌的临床分期成正相关，且有统计学差异；比较早期乳腺癌（Ⅰ期，Ⅱ期）与晚期乳腺癌（Ⅲ期，Ⅳ期）中的Ki-67表达情况（χ2=10.56P=0.001），差异有统计学意义；比较早期乳腺癌（Ⅰ期，Ⅱ期）与晚期乳腺癌（Ⅲ期，Ⅳ期）中p53的表达情况（χ2=4.44，P=0.035），差异有统计学意义。

表2 Ki-67及p53在三阴性乳腺癌与非三阴性乳腺癌中的表达Tab.2 Expressions of Ki-67and p53in TNBCand non-TNBC

在三阴性乳腺癌组中的Ki-67及p53的阳性表达率明显高于非三阴性乳腺癌组，其中Ki-67表达（χ2=5.357，P=0.021）和 p53表达（χ2=15.564，P<0.01），差异均有统计学意义。

3 讨论

通过基因微阵列分析，目前可以把乳腺癌分成5种亚型：激素受体阳性类luminal A型和luminal B型、c-erbB-2过度表达型、正常乳腺基因表达型以及基底细胞型。基底细胞型乳腺癌与正常乳腺基底上皮细胞表达相似，肿瘤细胞和基底细胞类似，同样表达细胞角蛋白分子CK5/6和CK17，并且缺乏ER、PR和c-erbB-2受体蛋白的表达。通常认为三阴性乳腺癌是基底细胞型乳腺癌的一个亚型［2］。Dent R等［3］通过1601例患者长达8.1年的随访发现，三阴性乳腺癌患者与非三阴性乳腺癌患者相比其远隔转移率高，且危险比为2.6，死亡概率增加3.2倍。

Ki-67蛋白是一种具有蛋白酶性质的碱性蛋白质，是维持细胞周期的绝对必需物质，可作为反映细胞增殖程度的标记物。Elkhuizen等［4］通过7502例患者的病例对照研究，得到三阴性乳腺癌的患者肿瘤易局部复发，并与Ki-67表达呈正相关的结论。Rosa等［5］通过RT-PCR及免疫组化的方法研究发现，Ki-67与ER及PR的转录和蛋白质表达呈负相关，而与淋巴结转移阳性密切相关，并由此提出检测Ki-67可能对判断肿瘤的预后有较大意义。本研究显示：Ki-67阳性表达率与临床分期具有相关性，随临床分期升高而升高，提示Ki-67可能与乳腺癌淋巴结转移情况及肿瘤的生长活跃程度密切相关，Ki-67在三阴性乳腺癌中过表达，与非三阴性乳腺癌比较差异有显著性统计学意义。

p53被认为是抑癌基因，突变后可导致p53所编码蛋白的功能丧失，失去抑制细胞周期运行和触发细胞凋亡的功能［6］。Herr等［7］在研究三阴性乳腺癌的病理特征时发现其多为组织学分级3级且p53蛋白表达多为阳性，并提示三阴性乳腺癌具有较强的增殖能力，易发生复发和转移，预后相对较差。本研究提示p53不仅在早期及晚期乳腺癌组存在差异（P=0.035），而且在三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组中的差异同样具有统计学意义（P<0.01），这提示p53不仅可作为判断肿瘤侵袭性及预后的标志，也是三阴性乳腺癌的一个潜在的特征性基因位点。

Rhee等［8］通过对683例乳腺癌患者的研究发现Ki-67及p53在淋巴结转移阴性的三阴性乳腺癌患者中过表达，且无病生存率低于非三阴性乳腺癌的患者。本研究联合检测Ki-67及p53，发现在三阴性乳腺癌中均呈高表达，从一定程度上解释了三阴性乳腺癌易复发转移预后较差的分子生物学原因，为判断三阴性乳腺癌预后提供了理论依据。

由于目前三阴性乳腺癌还缺乏有效地靶向治疗药物，是近年来的乳腺癌研究的热点，已经有表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼，原癌基因c-kit抑制剂伊马替尼投入到临床研究中［9］；而有文献提出针对雄激素受体的治疗也有可能成为三阴性乳腺癌新的治疗靶点［10］；近有报道认为雌激素受体亚型ER-β则有可能成为其内分泌治疗新方向［12］。因此通过研究Ki-67及p53蛋白在三阴性乳腺癌中的表达有助于三阴性乳腺癌的基因谱研究，并希望能够通过其表达通路找到更多的潜在治疗靶点。

（致谢：感谢中国医科大学盛京医院乳腺外科张文海教授、李建一主治医师给予的指导和帮助。）

［1］Carey LA，Dees EC，Sawyer L，et al.The triple negative paradox：primary tumor chemosensitivity of breast cancer subtypes ［J］.Clin Cancer Res，2007，13（8）：2329-2334.

［2］Perou CM，Sorlie T，Eisen MB，et al.Molecular portraits of human breast tumors［J］.Nature，2000，406（17）：747-752.

［3］Dent R，Trudeau M，Pritchard KI，et al.Triple-negative breast cancer：Clinical features and patterns of recurrence ［J］.Clin Cancer Res，2007，13（15）：4429-4434.

［4］Elkhuizen PH，Veogd AC，van den Broek LC，et al.Risk factors for local recurrence after breast-conserving therapy for invasive carcinomars：a case-control study of histoal factors and innocogene［J］.Radiat Oncol Biol Phys，1999，45（1）：73-83.

［5］Rosa FE，Caldeira JR，Felipes J，et al.Evaluation of estrogen receptor alpha and beta and progesterone receptor expression and correlation with clinicopathologic factors and proliferative marker Ki-67in breast cancers［J］.Hum Pathol，2008，39（5）：720-730.

［6］Linderholm BK，Lindald T，Holmberg L，et a1.The expression of vascular endothelial growth factor correlates with mutant p53and poor prognosis in human breast cancer ［J］.Cancer Res，2001，61（5）：2256-2060.

［7］Herr A，Glue O，Ting E，et al.Biological characteristics in triple negative high risk breast cancer and their clinical implications ［J］.JClin Oncol，2006，24（18s）：20032.

［8］Rhee J，Han SW，Oh DY，et al.The clinicopathologic characteristics and prognostic significance of triple-negativity in node-negative breast cancer［J］.BMCCancer，2008，23（8）：307-314.

［9］Cleator S，Heller W，Coombes RC，et al.Triple-negative breast cancer：Therapeutic options［J］.Lancet Oncol，2007，8（3）：235-244.

［10］Doanel AS，Danso M，Lal P，et al.An estrogen receptor-negative breast cancer sunset characterized by a hormonally regulated transcriptional program and response to androgen［J］.Oncogene，2006，25（29）：3994-4008.

［11］Rosa FE，Caldeira JR，Felipes J，et al.Evaluation of estrogen receptor alpha and beta and progesterone receptor expression and correlation with clinicopathologic factors and proliferative marker Ki-67in breast cancers［J］.Hum Pathol，2008，39（5）：720-730.

（编辑 裘孝琦，英文编辑 陈 姜）

Expressions of Ki-67and p53and Their Significance in Breast Cancer

JIAShi，ZHANGWen-hai，LIJian-yi，ZHANGYang
（Department of Breast Surgery，Shenjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo investigate the expressions of Ki-67and p53in ER-，PR-and c-erbB-2-negative（triple negative）breast cancer and their relationship with clinical stages.MethodsThe surgical specimens were sampled from 184cases of primary breast cancer，and the expressions of Ki-67and p53were determined with immunohistochemistry.ResultsThere were significant differences in the expression rates of Ki-67and p53between stagesⅠ and Ⅱ and stagesⅢ and Ⅳ of breast cancer（Ki-67，29.1%vs 61.5%，P<0.05；p53，25.9%vs 46.1%，P<0.05）and between triple negative breast cancer and non-triple negative breast cancer （Ki-67，48.3%vs 30.1%，P<0.05；p53，58.1%vs 22.9%，P<0.05）.ConclusionThe expressions of Ki-67and p53are closely correlated with the clinical stages of breast cancer.The overexpressions of Ki-67and p53in triple negative breast cancer may be contribute to the high invasiveness.

p53；Ki-67；breast cancer；immunohistochemistry

R655.8

A

0258-4646（2010）12-1061-03

贾实（1980-），男，医师，硕士.

张文海，E-mail：zhangwh@sj-hospital.org

2010-09-04