莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠Caspase-3活化程度的影响

汪莹,高东明,许栋明,王文,艾厚喜,张丽,李林

脑卒中是影响人类健康的三大疾病之一,严重地威胁着人们的身体健康和生活质量。在脑缺血早期,自由基损伤、兴奋性神经毒性和反复细胞膜去极化导致能量衰竭,引起级联式“瀑布反应”,破坏了“神经血管单元”(neurovascular unit)稳态,导致神经元细胞凋亡以及微血管、血脑屏障破坏[1]。中药在治疗脑卒中方面有显著的临床疗效。莫诺苷是从中药山茱萸中筛选出的有效成分。前期研究发现,莫诺苷对SY5Y神经细胞具有抑制过氧化氢损伤、抑制细胞凋亡、钙超载等作用[2-10],可提高局灶性脑缺血再灌注大鼠皮层总抗氧化能力[11],抑制氧化应激损伤,从而在基因表达水平上减少caspase-3的产生[12]。本试验进一步研究莫诺苷对局灶性脑缺血再灌注大鼠caspase-3活化程度的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 莫诺苷由首都医科大学宣武医院药物室从山茱萸中提取制备,HPLC分析纯度大于98.5%。维生素E:北京双鹤药业。caspase-3活性检测试剂盒(caspase-3 Activity Assay Kit):碧云天生物技术研究所(产品编号:C1116)。其他试剂为国产分析纯。

1.2 实验动物分组及给药 36只SPF级Wistar雄性成年大鼠,体重260～280 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,合格证编号:SCXK(京)2006-0009。随机分为:假手术组,模型组,莫诺苷小(30 mg/kg)、中(90 mg/kg)、大(270 mg/kg)剂量组和维生素E(35 mg/kg)组,每组6只。采用线栓法制备大鼠局灶性脑缺血再灌注模型,术后连续灌胃给药3 d,每天给药1次,其中假手术组和模型组给予等量的生理盐水。

1.3 模型制备 局灶性脑缺血再灌注模型采用改良Zea Longa线栓法[13]制备。大鼠用 10%水合氯醛0.35 ml/kg腹腔注射麻醉,仰卧位固定于鼠板上,颈部正中切口,钝性分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA),结扎颈外动脉和颈总动脉的近心端,动脉夹与颈总动脉近心端之间结扎一道缝合线,不扎紧。在颈总动脉接近颈外动脉和颈内动脉分叉处用眼科剪做一斜行细切口,将直径为0.26 mm的尼龙线插入,稍扎紧缝合线,推动尼龙线进入颈内动脉,至距颈外动脉和颈内动脉分叉处约2 cm时,会有阻挡感,说明栓线已越过大脑中动脉(MCA),到达大脑前动脉(ACA)的起始部。记录栓塞开始时间,结扎颈总动脉上端。缝合肌肉、皮肤。栓塞后30 min,若此时大鼠已苏醒则需要再次将大鼠麻醉,并拔出尼龙线。假手术组的大鼠除不插入尼龙线外,饮食等其他操作与手术组相同。

1.4模型成功及评价标准 参照Longa及Bederon的5分制评分方法[13-14]对实验动物进行神经行为学评分。将0分、1分及4分大鼠剔除,并补充各组设计所需大鼠数量。

1.5 caspase-3活性检测 脑缺血再灌注后72 h迅速断头取脑,冰生理盐水快速漂洗,彻底去除标本表面血液后,于冰盘上分离缺血侧脑组织。将大鼠缺血侧海马组织在电子天平上称重后,按照每10 mg组织加入100 μ l裂解液的比例加入裂解液,在冰浴上用玻璃匀浆器匀浆;把匀浆液转移到1.5 ml离心管中,冰浴再裂解5 min后,4℃、15000 g离心15 min。caspase-3活性检测按照试剂盒说明书操作要求进行,同时取少量样品用Bradford法测定蛋白浓度,并按试剂盒提供的酶活力单位定义进行换算。

2 结果

与假手术组相比,模型组caspase-3活性显著上升(P ＜0.001);服用莫诺苷 30 mg/kg、90 mg/kg、270 mg/kg后,活性呈剂量依赖下降(P＜0.05);服用维生素E后,caspase-3活性显著降低(P＜0.001)。见表1。

表1 各组caspase-3活性比较(U)

3 讨论

脑缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury)在缺血性脑血管的病理生理过程起着重要的作用。脑梗死后超早期溶栓治疗是恢复脑血流,挽救缺血脑组织的最佳方案;但血液再灌注会导致严重的迟发性神经元损伤。近年来研究发现,脑缺血再灌注损伤过程与细胞凋亡有着密切的关系,凋亡机制参与脑缺血再灌注损伤已成为临床研究的热点。

凋亡机制涉及一组半胱氨酸蛋白酶家族,称为caspases。caspase家族是一大类凋亡的调控因子,是细胞凋亡的启动者和最后的执行者。研究表明,在caspase家族中,caspase-3是caspase级联“瀑布”下游最关键的凋亡执行蛋白酶[15-16]。它在正常细胞中以酶原形式存在,也称Pro-caspase-3;当受到凋亡刺激因素(缺血、细胞内钙超载等)作用后,caspase-3前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽,然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基,并进而形成两两组成的有活性的四聚体即活化caspase-3,从而形成酶的活化形式并作为凋亡的效应分子执行凋亡过程。活化的caspase-3可以激活核因子、细胞骨架蛋白及DNA裂解酶等,引起细胞形态的变化,如出现细胞皱缩、DNA裂解、染色质浓缩和凋亡小体的形成等,最终导致细胞凋亡。caspase-3在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。

活化的caspase-3作为凋亡最终的主要执行者,其活性的变化间接反映组织细胞损伤的程度。已有实验通过Western blot的方法证明莫诺苷可在基因水平上减少Pro-caspase-3的产生[12],即降低酶原的产生。本实验利用分光光度法对caspase-3的活性进行检测,结果表明莫诺苷能够抑制脑缺血再灌注损伤后脑组织中caspase-3活性的升高。结合已有研究[7,12],我们推测莫诺苷可能对caspase-3的基因表达和caspase-3蛋白酶的激活均有抑制作用,减少脑缺血再灌注后脑组织中caspase-3的表达与激活,从而抑制神经细胞凋亡,达到对神经细胞的保护作用。

莫诺苷在动物实验中表现出明显的抗凋亡能力,能抑制局灶性脑缺血再灌注大鼠caspase-3的活化。其神经保护作用值得进一步研究探讨。

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