猪霉形体体外药物敏感性试验

李晓云,贾杏林

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

猪霉形体（Mycoplasma suis，M.suis）是猪附红细胞体病病原，其感染率极高，可导致贫血、黄疸、生长发育迟缓、免疫功能受损、对猪的其他呼吸道和肠道疾病的易感性增加。猪霉形体的感染会诱发很强的免疫反应，但对动物无明显的保护作用，因此对发病动物的治疗主要依赖药物。已报道过的临床用药种类繁多，但是在已经研究过药物中未发现能持续清除猪霉形体的药物，对首选治疗药物一直存在争议，结果导致抗生素滥用，造成附红体菌株耐药性增加、动物性食品的药物残留等问题。本研究在李晓云等建立的猪霉形体体外无细胞培养的基础上，通过直接观察药物作用效果、比较染虫率、溶血率等的变化评价了强力霉素等8种抗生素对猪霉形体的杀灭作用，以期为高效安全药物筛选、猪附红细胞体病的防治等提供一定的依据。

1 材料与方法

1.1 病原及红细胞

无菌静脉采集疑似患附红细胞体病猪血，柠檬酸三钠抗凝，对采集的红细胞涂片后进行Giemsa染色镜检，参考Hoelzle等的方法进行PCR鉴定。以上方法鉴定为猪霉形体阳性的血样低温保存备用。

1.2 培养基和主要试剂

试验用培养液的配制参考文献3。强力霉素、土霉素 （含量大于99%）、酒石酸泰乐菌素（1mg效价不少于800泰乐菌素单位），购自中国兽医药品监察所；氟苯尼考注射液，江苏金牧王药业有限公司；硫酸新霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素为Amresco进口分装。将上述药品用适宜的方法配制成相应的浓度贮存液，过滤除菌，－20℃保存备用，临用前用培养液稀释成相应浓度的应用液（见表 1），调 pH至 7.4，4℃保存备用。

1.3 病原接种与培养

参考李晓云等的方法将猪的染虫红细胞用含不同浓度药物培养液替代PPLO-S-BS进行培养，每种药物的每个浓度设3个重复，每24h用含相应药物的培养液更换培养孔中1/2体积的上清部分培养液。

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1.4 结果判定

培养开始后观察红细胞和虫体的变化，统计红细胞M.suis染虫率（PPE）、染虫强度、虫体颗粒大小、活力，染虫率统计方法是于400倍倒置显微镜下，分别从3个不同的视野直接计数200个红细胞，统计平均染虫率，以红细胞上观察到1个以上的虫体寄生即判为阳性。试验结果用STATISTICA软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 药物作用对猪红细胞染虫率、染虫强度的影响

药物作用之前红细胞染虫率达86.7%，红细胞形态不规则，呈棘球状或锯齿状。加入药物后，红细胞染虫率变化见表1。强力霉素（≥100μg/mL）、土霉素（≥1000μg/mL）作用后，PPE 与对照差异显著（p＜0.05）；土霉素（≤100μg/mL）、各浓度的酒石酸泰乐菌素、氟苯尼考、新霉素、庆大霉素、链霉素、青霉素作用后M.suis PPE与空白对照差异不显著。

对染虫强度的影响：药物作用之前单个红细胞可见的染虫数量平均达5～10个以上，强力霉素、土霉素（≥100μg/mL）作用后红细胞上可见虫体的数量减少，平均只有0～3个，红细胞形态恢复圆形；其他几种抗生素对猪霉形体染虫强度无明显影响。

2.2 有效药物对M.suis的杀灭作用

上述明显影响M.suis染虫率的药物作用于染虫红细胞后，虫体首先从红细胞上游离至培养液中，作升降、扭转、翻滚、伸屈、摇摆、转圈等多种形式的运动，后运动减弱，虫体消失不见。红细胞原有的振颤、摆动、小范围滑行、滚转等运动特点也随虫体数量的减少减弱直至静止不动。

3 讨论

由于M.suis的体外培养大量增殖难题尚未破解，用传统的药敏试验方法检测其对药物的敏感性受到限制。本研究参考李晓云等建立的M.suis体外培养方法，将受试药物加入培养体系中，可随时于镜下直接观察虫体及染虫红细胞的变化。这一方法与郑海红等、张守法等的方法相比，具有结果更直观，统计更接近培养的自然状态的优点。

对M.suis有明显杀灭效果的强力霉素、土霉素等有效浓度较高，远远高于霉形体属的有效药物抑制浓度，临床上也报道药物难以消除感染M.suis动物的带虫状态，据此我们推测M.suis的抗药能力比较强，这可能是临床上难以消除M.suis的原因之一。

部分药物或某些药物的低浓度作用后，PPE不降反升（差异不显著），分析其原因，一方面是药物对M.suis无抑制作用，另一方面培养过程中虫体可能有少量的增殖或部转移到未感染的红细胞上。

临床上常用的青霉素、链霉素、氟苯尼考、新霉素、庆大霉素等抗生素，以及对大部分霉形体属有抑制作用的泰乐菌素，在本试验中即时使用较高浓度也未观察到其对M.suis的杀灭作用，因此，临床上发生附红细胞体病后应慎用抗生素。更多有效药物的筛选有待进一步研究。

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