固定化脂肪酶催化酯交换制备生物柴油的研究进展

王建龙 谢文磊

（河南工业大学化学化工学院，河南郑州，450001）

固定化脂肪酶催化酯交换制备生物柴油的研究进展

王建龙 谢文磊

（河南工业大学化学化工学院，河南郑州，450001）

生物酶法生产生物柴油具有化学催化法不可比拟的优越性，是工业化生产的发展方向。介绍了固定化脂肪酶在催化油脂酯交换制备生物柴油方面的应用，对影响酯交换反应的脂肪酶源、底物摩尔比率、酰基受体、水含量、反应温度、副产物等因素进行了综述。

固定化脂肪酶 酯交换 生物柴油 影响因素

石油资源日趋枯竭和石化能源造成的空气污染促使人们寻找可再生替代能源。生物油脂和甲醇酯交换的产物脂肪酸甲酯（生物柴油）可作为柴油的替代品。与普通柴油相比，生物柴油具有高十六烷值、含硫量低、可生物降解和闪点高等优点；而且燃烧废气中微粒子、总碳氢化合物、SO2和CO含量低，是一种新型绿色环保染料［1，2］。

生物柴油可用酸、碱或酶催化油脂和甲醇进行酯交换而生产。典型生产方法是用在甲醇中溶解度较大的碱金属氢氧化物或甲氧基钠为均相催化剂，其催化活性与其碱度有关。均相碱催化剂虽在较低温度下可获得较高收率，但对原料中游离脂肪酸和水含量有较高要求。游离脂肪酸会使催化剂失活，易使反应体系乳化，导致产品难以分离。均相酸催化剂（H2SO4、H3PO4、HCl等）在游离脂肪酸含量较高的油料中较有效，但这类催化剂一般存在活性低、副反应多、反应温度高、需甲醇较多过量及腐蚀设备等缺点。酶催化剂的反应条件温和，但副产物甘油会聚集在固定化酶表面，影响催化活性；而且价格高、反应时间长、甲醇对脂肪酶有毒性。本文介绍了固定化脂肪酶在催化油脂制备生物柴油方面的应用及主要影响因素。

1 固定化脂肪酶在制备生物柴油方面的应用

酶的固定化就是通过化学或物理方法，将水溶性的酶结合在水不溶性的支持物上或酶被载体包埋。与溶液中游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶更稳定，对环境的改变更具适应性。更重要的是，非均相固定化脂肪酶易回收，可多次重复使用，工艺过程可连续操作，并促使设计更多种类的生化反应器。目前，用于合成生物柴油的脂肪酶主要有酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪酶、猪胰脂肪酶等。而常用的载体材料有沸石、分子筛、磁性载体材料、球状特大孔树脂等。脂肪酶对载体材料有很高的要求，如高比表面积、亲疏水性、物化稳定性及抗降解性等。表1列举了用于制备生物柴油的部分固定化脂肪酶。

Nadir Dizge和Coskun Aydiner等［14］在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化三种油脂制备生物柴油的反应中，研究了载体形状对脂肪酶固定化和甲酯产率的影响。结果发现:球状、片状、粉状载体对脂肪酶的固定率分别为80%、85%、89%；而且，粉状固定酶催化葵花籽油反应生成甲酯产率最高（97%）。

磁性物质作为一种绿色材料是近年来研究较多的材料。纳米Fe304由于粒径小、比表面积大、磁性强，具有表面效应、磁效应等，使它在颜料、磁流体、磁性微球、磁记录、催化、电子等领域得到了广泛的应用，越来越引起人们的关注。谢文磊［15，16］等研究了磁性Fe3O4微球固定化脂肪酶催化大豆油的酯交换反应。采用硅烷偶联剂活化、戊二醛交联和碳二亚胺活化两种方法制备磁性固定化脂肪酶，催化酯交换反应所得脂肪酸甲酯产率都达90%以上，且固定化酶在重复利用3～4次后活性降低很少。

表1 制备生物柴油的部分固定化脂肪酶

2 固定化酶催化制备生物柴油的主要影响因素

2．1 脂肪酶的选择

来源不同的脂肪酶对底物的活性不同，Turkan等［17］在三种不同的固定化脂肪酶催化葵花籽油甲醇解的研究中发现:来源于根霉菌和疏绵状嗜热丝孢菌的脂肪酶催化酯交换的第一步反应即甘油三酯转化为甘油二酯的反应较快；而来源于南极假丝酵母的脂肪酶催化后两步反应即甘油二酯转化为单甘油脂和单甘油酯转化为酰基酯的反应较快。因此，Turkan等认为在制备生物柴油中使用两种脂肪酶比使用一种脂肪酶催化反应更具优越性。

2．2 底物摩尔比率的影响

过量的醇可以增加酯交换反应产率，但也会使酶活性降低甚至失活，尤其在非均相反应体系中较显著。加入有机溶剂能增加醇的溶解性，抑制酶失活，从而提高生物柴油的产率。例如，在正己烷中，甲醇／葵花籽油的摩尔比为3∶1，固定化荧光假单胞菌脂肪酶催化反应24h小时后，甲酯转化率达72%；在同样条件下，来源于根霉菌、疏绵状嗜热丝孢菌和洋葱假单胞菌三种固定化酶催化酯交换反应48h后，甲酯转化率近80%［18］。

过量的醇是提高酯交换产率的先决条件，但反应过程中须保持低浓度的醇。因此，Soumanou和Bornscheuer［18］在根霉菌脂肪酶催化制备生物柴油的反应中，将醇分为三部分（每部分醇／油摩尔比为1∶1）分步加入到反应体系中，24h后产率分别为84%。通常酶法催化制备生物柴油过程中，在有机溶剂体系中需要稍微过量的醇（大于醇油化学计量摩尔比率即4～5∶1），可达到较高的酯产率；无溶剂体系中醇应分步加入，而第一步酯交换反应时要考虑醇在油中的溶解性及温度的影响。

2．3 体系中水含量的影响

在酶法催化制备生物柴油的反应体系中加入适量的水能够增加脂肪酶的催化效率，有利于提高酯交换反应产率，因为水充当维持酶活性构象的“润滑剂”，可使酶分子的柔性增加，但过量的水也会促使酶分子聚集成团，导致酶活性下降，从而使产物转化率降低［6，19］。因此，含水量须适中，以使酯键水解率保持在较低的水平，从而确保较高的生物柴油产量。

Noureddini等［20］在无溶剂体系下使用洋葱假单胞菌脂肪酶催化大豆油和甲醇、乙醇的酯交换反应，发现:在乙醇解反应中，当水含量为0．2－0．5g时，生成的酯量减少；在甲醇解反应中，加入0．01－2g的水量时，脂肪酸含量逐渐增加，甲酯产率明显下降。Shah和Gupta［4］在以洋葱假单胞菌脂肪酶为催化剂催化麻疯果油／乙醇的酯交换反应中，也研究了水含量对反应的影响。水含量从1%增加到10%（w／w的酶量），酯交换产率增加。当水含量为5%，反应5h后产率达到98%，而不加水时产率仅有70%。因此体系中最佳含水量可加快酯的合成速率，使游离脂肪酸的浓度最低。

2．4 温度的影响

不同的脂肪酶在无溶剂体系中催化酯交换反应的最佳温度范围基本相同（30－50℃）。Iso等［3］在研究荧光假单胞菌脂肪酶催化合成油酸乙酯的反应中发现:在30－55℃之间，酯交换反应速率随着温度的增加而增加。Xu等［21］在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化制备生物柴油的实验中（醇油摩尔比1:1）发现:当温度从30℃逐渐升到40℃时，反应速率逐渐增大；当升至50℃时，反应速率不再增加。但醇油摩尔比增大，升高温度将会加快酶的失活。Du等［19］在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶催化反应发现温度、酯交换反应速率和脂肪酶稳定性之间的影响关系与Xu等实验结果相同。温度从30℃升高到40℃，加快了反应速度，但降低了脂肪酶的稳定性。

因此，酶法催化酯交换反应的最佳温度主要取决于生物催化剂稳定性和酯交换反应速率之间的相互影响，也受到醇油摩尔比、有机溶剂和酶热稳定的影响。

2．5 副产物甘油的影响

大量的实验证实在酯交换反应中副产物甘油会抑制脂肪酶的活性，尤其是连续的或重复批次的工艺反应。Dossat和Du等［22，19］发现甘油的存在会使固定在亲水材料上的脂肪酶活性明显降低，因为甘油分子吸附在载体表面形成亲水层，阻碍了酶分子接近疏水性底物。因此在反应系统中加入另一中亲水的底物如丙酮或硅胶，可以吸附在硅胶上除去部分甘油，从而提高酯交换效率。Du等［19］还注意到使用异丙醇洗涤固定化脂肪酶，可以除去载体上的甘油而恢复酶的活性。

Li等［23］在固定化疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶和Novozyme435固定化脂肪酶催化制备生物柴油的研究中，提出了另一种降低甘油影响的方法，即在亲水性有机溶剂叔丁醇中进行菜籽油与甲醇的酯交换反应，能够使甘油很好地溶解到溶剂中，而不会在载体上形成一层膜。叔丁醇能较好的溶解甘油和甲醇，避免了甲醇引起酶的变性。

3 展望

生物柴油作为石油柴油的替代燃料，它的发展不仅有利于解决能源问题，而且可以减少温室气体的排放量，减少环境污染，这些都是吸引发展生物柴油的主要原因。

近年来，酶固定化技术已在食品工业、化学品工业、医药、生物传感技术，尤其是生物柴油方面得到广泛的应用，在废水处理方面也取得了一定进展。但我国固定化酶催化制备生物柴油还难以大规模应用，其原因主要在于生产成本高和生产工艺不成熟，可见需提高固定化脂肪酶和固定化细胞催化转酯化反应的转化率及其重复使用批次以降低酶催化酯交换法生产生物柴油的成本，同时要进一步改进固定酶催化酯交换的生产工艺。目前比较有前途的研究项目是将酶的固定化与酶的选择性修饰结合，将酶的固定化与细胞的固定化结合，这样我们可以对酶的改造、酶的结构、功能、作用机理有更深的了解，也将大大有利于在生物柴油等方面的应用。

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Abstract:The bio－enzymatic method possesses unparalleled advantages over conventional chemical catalysis，and would be the direction in biodiesel industrialization process．The application progress of immobilized lipase catalysis on synthesis of biodiesel by the transesterification was introduced．In addition，the influence factors of the transesterification，such as source of lipases，molar ratio of the substrates，acyl acceptors，water content，reaction temperature，the byproduct of glycerol and so on，were summarized．

Key words:immobilized lipase；transesterification；biodiesel；influence factors

Research Progress on Immobilized Lipase Synthesis of Biodiesel

Wang Janlong，Xie Wenlei
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Henan University of Technology，Henan Zhengzhou 450001，China）