益气活血中药复方对CVB3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ表达的影响＊

张明雪，曹洪欣，车红花，何 伟，顾 平

（1.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032；2.中国中医科学院，北京 100700）

本实验采用新生2d～3d大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3（CVB3）感染模型，通过改良抑制性消减杂交技术（SSH），克隆受 CVB3攻击的宿主细胞中被中药（益气活血中药复方）调控的基因。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 新生2d～3d wistar大鼠，由辽宁中医药大学实验动物中心提供。

1.1.2 药品及制备 CVB3m嗜心肌毒株由哈尔滨医科大学微生物实验室提供；益气活血中药复方由黄芪、白参、丹参、郁金、麦冬、白茅根等药组成，制成含生药浓度为1g/ml的注射液，由沈阳药科大学药学院制备。

1.2 方法

1.2.1 乳鼠心肌细胞的分离和培养 剪取乳鼠心室肌，用预冷 HBSS液冲洗3遍，剪为1mm3碎块，0.25％胰蛋白酶，37℃水浴震荡消化 50min～60min，加适量10％胎牛血清中止消化，1000r/min离心10min弃上清液，加入8ml HBSS液洗涤细胞，1000r/min离心10min弃上清液，加入含10％胎牛血清的 DMEM培养液混匀细胞沉淀，过200目滤网，经60mm培养皿纯化1.5h后，将细胞分为2组，1组为病毒感染组，1组为病毒感染加益气活血中药复方组，于5％CO2培养箱中孵育。

1.2.2 CVB3病毒性心肌炎模型的建立［1～3］培养72h后，在已呈规律同步搏动的2组各瓶细胞中，分别加入含CVB3（在HeLa细胞上滴定CVB3病毒毒力为 10－8TCID50）的 1640生长液 1ml，吸附1.5h后一组加入10％胎牛血清1ml为 tester；另一组加以1∶16的10％胎牛血清稀释的益气活血中药复方1ml为 driver，继续培养24h后，吸出各培养瓶中的液体，用HanK氏液冲洗各组细胞，0.25％胰酶消化3min～5min，收集细胞至离心管中，1200r/min离心10min，提取 mRNA。

1.2.3 细胞mRNA的提取 mRNA的提取使用 Pharmacia公 司 的 QuickPrepRmicromRNA purification试剂盒，详细步骤按操作说明进行，提取的总RNA于分光光度计（Backman 640）定量。

1.2.4 双链cDNA的合成 采用CLONTECH公司PCR-Select TMcDNA SubtractionKit提供的试剂和酶，分别以上述 driver和 tester mRNA为模板，进行单链及双链cDNA的合成。

SSH方法利用的寡苷核酸：以下是应用于SSH的寡核苷酸（均由 Clontech公司的PCR-select［TM］cDNA subtraction kit试剂盒提供）：ADAPTER-1：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3′，3′-GGC CGT CCA-5′；ADAPTER-2R：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGA GGT-3′，3′-CGGCTCCA-5′。

第1轮 PCR引物：5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGCC-3′；第2轮 PCR引物：NESTEDPCR引物1：5′-TCG AGCGGCCGC CCG GGC AGGT-3′；NESTEDPCR 引物 2R：5′-AGC GTG GTC GCG GCC GAG GT-3′。

1.2.5 SSH差减杂交 详细操作过程按Clontech公司的 PCR-selectTMcDNA subtraction kit试剂盒说明书进行。利用glassmilk将PCR扩增产物即差异cDNA片断回收并克隆到pGEM-T easy载体中，连接产物转化XL1-Blue菌，随机筛选30个白色克隆，挑单菌落于3ml LB培养基中，培养12h～16h，取1ml菌液用于测序，余下菌液以20％甘油 －80℃保存。

1.2.6 测序 由上海英骏生物技术有限公司测序。

1.2.7 GenBank序列比较 将测序结果通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/进行序列比较，寻找该片段在基因组和dbEST中是否有明显同源的序列。

1.3 结果

1.3.1 SSH结果 以病毒组心肌细胞cDNA为tester，以病毒感染同时有益气活血中药复方促进的心肌细胞 cDNA为 driver，两组 cDNA进行杂交，得到的消减杂交文库稀释1000倍后，作为PCR扩增的模板。PCR产物连接到pGEM-T easy载体中，进行DNA序列分析。

表1显示，通过序列测定结果，在ncbi的blastn结合 blastx分析，得到如下结果（部分）并列于下表。

表1 利用SSH技术研究益气活血中药复方促进表达的基因

表2 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR扩增Ct值

1.3.2 荧光定量rt-PCR验证结果 图1、2和表2、3显示，细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因在中药组中的表达均比病毒组中高，说明该基因的表达可被益气活血中药复方上调。

图1 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR扩增曲线图

表3 Cytochrome c oxidase subunitⅠ基因rt-PCR扩增Ct值

图2 Cytochrome c oxidase subunitⅡ基因rt-PCR扩增曲线图

4 讨论

病毒性心肌炎属中医学“温病”、“心悸”、“胸痹”、“心痹”、“怔忡”、“虚损”等范畴。本病发病因身体素虚复感外邪所致。病位涉及心、肺、脾、胃等脏腑，其中以心为主要病位。《素问·灵兰秘典论》曰：“心者，君主之官也，神明出焉”；《诸病源候论》云：“心藏神而主血脉，虚劳损伤血脉，致令心气不足，因为邪之所乘，则使惊而悸动不安。”心位于胸中，主血脉，气为血帅、血为气母，气行则血行，若心气虚、运血无力，血脉运行不畅则心血瘀阻。本病病机以正虚为本，血瘀为标。有学者认为，该病后期容易耗气并致心脉瘀阻［4］，“毒、瘀、虚”三者胶结贯穿始终；早期心肌细胞变性坏死，心肌组织缺血、缺氧、心肌间质水肿，大量的自由基堆积局部，心肌微循环障碍，此即为瘀血，故早期治疗往往于方中加入活血化瘀之品［5］。益气活血法用于病毒性心肌炎的临床治疗，已得到肯定疗效［6］。益气活血中药复方以黄芪、白参为主药，大补元气，固脱生津，安神。黄芪性微温、味甘，归肺脾经，补脾胃而建立中气，护卫固表。药理实验表明，黄芪具有强心、利尿、降压、保肝、提高免疫功能的作用，对感染病毒以及药物中毒的心肌均有明显的保护作用，黄芪总黄酮在病毒性心肌炎急性期可改善病毒性心肌炎引起的泵功能的损害［7～9］。白参性味甘平，归脾、肺经，大补元气，补脾益肺，生津养血，宁神益智。人参能增强机体免疫力，也对动物心肌无力等症状有改善作用［10］。丹参始载于《神农本草经》，色赤，味苦，微寒，归心肝经，能活血化瘀、通心脉、补养心血。有实验表明，丹参保护心肌，可促进冠状动脉的流量，有减轻心肌缺血损伤程度和加速恢复的作用［11］。郁金归心、肝、肺经，可行气化瘀，清心安神为臣药。麦冬性微寒味甘质润，有滋阴润肺、益胃生津、清心除烦的功效，对心血管系统与免疫系统均有良性作用［12］。白茅根味甘、性寒，入肺、胃、膀胱经，清泻湿热、利尿，能除伏热、导湿热，从小便而出，以防余热之邪恋结体内。《神农本草经》谓其：“主治劳伤虚羸，补中益气，除瘀血，血闭，寒热，利小便。”二药与黄芪、人参配伍，共奏益气养阴之效，且甘寒之白茅根可导伏热与湿热下行，从小便而走；微寒之麦冬，可清解心肺客热，恰合本病温热之邪易耗气伤阴的病机特点。诸药合用，使心气得补，乃行血有力，血行络通，而无留滞之患，共收益气活血之效。本方兼以清热养阴，与君臣药配伍，达标本同治目的，体现了中医学“治病求本，兼顾其标”的整体辨治理念。

心肌能量代谢障碍和心功能减退是病毒性心肌炎重要的病理生理特征。大量研究表明，VMC心功能减退与心肌细胞数量减少、结构蛋白改变、离子泵功能障碍等多种因素有关［13］。VMC急性期病毒通过心肌细胞的相关受体侵入心肌细胞，在细胞内复制、溶解细胞后得以扩散。在病毒感染过程中，吸附穿入细胞及扩散出细胞都会对细胞膜、线粒体膜造成直接损伤［14］，引起线粒体内膜上 Ca2+-ATP酶的活性下降和线粒体钙化。病毒血症使氧自由基生成增加及引发脂质过氧化水平增强。线粒体的含量占心肌细胞容积的35％～40％，线粒体不仅承担着心肌90％的能量供应，且在调节细胞内 Ca2+浓度、细胞凋亡的发生等方面起着重要作用［15］。细胞色素C氧化酶（复合物 IV）是线粒体内膜的固有成分［16］，线粒体是进行三羧酸循环、氧化磷酸化的重要细胞器，其能量合成需要内膜上呼吸链关键酶——细胞色素氧化酶的参与［17］。细胞色素 C为生物氧化过程中的电子传递体，其作用原理为在酶存在的情况下，对组织的氧化、还原有迅速的酶促作用。细胞色素 C可以在呼吸链复合酶Ⅲ（细胞色素还原酶）和 IV（细胞色素氧化酶）之间传递电子［18］。氧化态的细胞色素C可直接清除O2－，还原态的细胞色素C可清除H2O2，且线粒体的氧自由基代谢状态与细胞凋亡之间存在因果关系［19］。细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ通常被称为核心亚基［20］。细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因属于线粒体基因，其编码的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ是呼吸链的重要组成部分［21］，且细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ是细胞色素C氧化酶的活性中心，其活性的改变导致线粒体呼吸链的电子传递受阻，并直接将电子泄漏于线粒体基质内，使超氧阴离子产生增多，导致线粒体内的氧应激水平提高［22］。

抑制性消减杂交技术是一种有效的差异表达基因分离方法，其基本原理如下：首先将两个群体的mRNA反转录为cDNA，其中含有特异表达基因的样本为 tester，另一组为 driver，tester和 driver cDNA杂交，去除杂交体 cDNA，未形成杂交体的 cDNA即是在tester中特异表达或高表达而driver中不表达或低表达的基因。抑制性消减杂交技术的优点是，因为被扩增和克隆的双链 cDNA的每条链来源于第1次杂交的不同体系且又进行了第2次杂交，所以具有很高的特异性［23］，尤其在筛选低丰度表达基因之间的差异方面更有优越性。在本研究ssh结果中，中药组与病毒组相比，细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ基因表达增强，其可能的机制是益气活血中药复方使受感染心肌细胞的细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ基因活性增加，从而提高线粒体的氧应激水平，抑制CVB3感染后细胞凋亡的发生，达到保护心肌细胞、治疗病毒性心肌炎的目的，并将为病毒性心肌炎的防治提供新的理论基础和实验依据。

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