健脾止泻颗粒对脾虚证及抗生素肠道＊菌群失调模型小鼠的微生态调节作用

李秋明，张亚杰，张大方，刘 佳，李丽静

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

健脾止泻颗粒是以黄连、白术等6味药为组方的健脾止泻药，临床主治脾肾虚寒型泄泻。为观察其药效作用，我们进行了以苦寒泻下中药大黄造成小鼠脾虚模型，选用厌氧及需氧菌选择性培养基测定粪便中代表性菌种含量，以盐酸林可霉素造成肠道菌群失调模型，选用厌氧及需氧菌选择性培养基测定粪便中代表性菌种含量等实验模型观察健脾止泻颗粒对肠道菌群的影响，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物

昆明种小白鼠，雌雄各半，体重20g±2g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，动物合格证号为 SCXK-（吉）2008-0001。

1.2 药物

健脾止泻颗粒由课题制剂组提供，规格为0.5g/片，每克含生药4g，批号20090311。使用时用生理盐水制成混悬液灭菌后4℃保存备用；大黄：蓼科植物唐古特大黄，水煎成1ml含1g生药的水煎液，灭菌后4℃保存备用；丽珠肠乐购于吉林省吉深药店，丽珠医药集团股份有限公司生产，批号090321；硫酸庆大霉素注射液为天津药业集团新郑股份有限公司，8万单位/支，0908271。

1.3 培养基

双歧杆菌培养基（BS）、乳杆菌培养基（LBS）、伊红美兰平板（EMB）、葡萄球菌选择培养基（SP）均购于青岛海博生物技术有限公司。细菌培养用营养琼脂、营养肉汤（北京奥博星生物技术有限责任公司）。

1.4 菌株

大肠埃希菌（ATCC44102）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）、痢疾杆菌（ATCC27336）、金黄色葡萄球菌（ATCC26003）均购于中国药品生物制品检定所，为本室保藏。

1.5 仪器

全温振荡培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司，HZQ-F160）；电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司，DHG-9123A）；手提式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司，YXQ-LS-18SL）；超净工作台；金属单道移液器（丹麦Cappelen，CappAero）；分析天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司，AL204）；磁力加热搅拌器（国华电器有限公司，78-1）。

2 方法与结果

2.1 健脾止泻颗粒对脾虚小鼠肠道菌的影响

2.1.1 分组及造模 将雌雄小白鼠随机分成正常对照组、造模组、阳性对照组与健脾止泻颗粒高、中、低治疗组，每组6只，雌雄各半。除正常对照组外，其余各组依文献［1］所述脾虚造模方法灌胃大黄煎汁造模7d，获得脾虚证模型。然后各组分别以0.5、1、2mg/kg剂量灌胃健脾止泻颗粒7d。造模组同期灌胃生理盐水，阳性对照药给予丽珠肠乐。

2.1.2 标本采集与培养 按摩小白鼠腹部促其排便，将粪便置于无菌纸上称量后迅速转移至灭菌研瓶内捣碎，然后用无菌生理盐水做对数稀释。取10倍连续稀释液，用微量移液器取20μl滴于培养基表面，然后迅速置于厌养培养箱中培养72h。肠道需氧菌群检测时粪便标本依预试结果选取10－3、10－4、10－5、10－6稀释度，接种后在需氧条件下37℃培养24h之后计数典型菌落。

进行双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌的培养和菌落计数。各种菌培养方法如下。双歧杆菌：BBL琼脂，37℃ 48h～72h厌氧培养；乳杆菌：LBS琼脂，37℃ 48h培养；肠杆菌：EMB琼脂，37℃24h～48h培养；肠球菌：Ec琼脂，37℃ 24h～48h培养。

2.1.3 统计方法 每克标本的菌落数=典型菌落数÷稀释度 ×50。检测值一般较大，为计算方便将其转换为对数值，即lgCFU/g形式。应用SPSS统计软件进行统计学处理。

2.1.4 实验结果

一般体征：造模鼠自第2天起开始出现软泥样便，第5天出现腹泻便溏、食欲不振、畏寒扎堆等脾虚症状。随着造模的进行上述症状逐渐加重。造模1周后自然恢复鼠的脾虚证状基本保持不变。健脾止泻颗粒治疗组随着治疗的进行，脾虚证状明显改善，至服药完毕时一般体征恢复正常。

表1 健脾止泻颗粒对脾虚小鼠肠道厌氧菌的影响±s，n=6）

表1 健脾止泻颗粒对脾虚小鼠肠道厌氧菌的影响±s，n=6）

注：与正常对照组比较：###P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，△△P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量（g/kg）双歧杆菌lgCFU/g乳杆菌lgCFU/g正 常 对 照 组10.335±0.129 10.274±0.065模 型 对 照 组 9.787±0.035### 9.962±0.076###丽 珠 肠 乐 组 10.929 ±0.074＊＊＊ 10.536 ±0.041＊＊＊健脾止泻颗粒高剂量组 2 10.108±0.100＊＊＊ 10.207±0.076＊＊健脾止泻颗粒中剂量组 1 10.014±0.440＊＊ 10.076±0.049*健脾止泻颗粒低剂量组 0.5 9.978±0.208*9.997±0.063

表2 健脾止泻颗粒对脾虚小鼠肠道需氧菌的影响±s，n=6）

表2 健脾止泻颗粒对脾虚小鼠肠道需氧菌的影响±s，n=6）

注：与正常对照组比较：△△P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量（mg/kg）肠杆菌lgCFU/g肠球菌lgCFU/g正 常 对 照 组7.075±0.029 6.528±0.033模 型 对 照 组 7.393±1.061### 6.555±0.023#丽 珠 肠 乐 组 7.378±0.046 6.532±0.022健脾止泻颗粒高剂量组 2 7.165±0.034＊＊＊ 6.377±0.076＊＊健脾止泻颗粒中剂量组 1 7.344±0.082* 6.508±0.051*健脾止泻颗粒低剂量组0.5 7.386±0.046 6.529±0.050

2.2 健脾止泻颗粒对抗生素引起小鼠肠道菌失调的影响

2.2.1 分组及造模 将雌雄小白鼠随机分成造模组与治疗组，每组6只，雌雄各半。依文献［1］所述抗生素引起小鼠肠道菌失调模型为每天灌胃盐酸林可霉素0.2ml/只，造模5d，获得抗生素引起小鼠肠道菌失调模型。然后按2、1、0.5g/kg剂量灌胃健脾止泻颗粒7d。造模组同期灌胃生理盐水，使其成为自然恢复对照组。

2.2.2 标本采集与培养（同2.1.1）

2.2.3 统计方法（同2.1.3）

2.2.4 实验结果 一般体征：各组动物外观体征没有明显区别，饮食、毛板、活动、体重增长情况均无明显差异。

表3 健脾止泻颗粒对抗生素菌群失调模型小鼠肠道厌氧菌的影响±s，n=6）

表3 健脾止泻颗粒对抗生素菌群失调模型小鼠肠道厌氧菌的影响±s，n=6）

注：与正常对照组比较：△△P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量（mg/kg）双歧杆菌lgCFU/g乳杆菌lgCFU/g正 常 对 照 组10.411±0.072 10.274±0.053模 型 对 照 组 9.484±0.116###△△ 9.654±0.049△△丽 珠 肠 乐 组 9.770±0.099＊＊ 10.175±0.114＊＊健脾止泻颗粒高剂量组 2 9.604±0.037* 9.669±0.051健脾止泻颗粒中剂量组 1 9.538±0.053 9.605±0.081健脾止泻颗粒低剂量组0.5 9.530±0.056 9.595±0.032

3 讨论

泄泻可能为外邪（主要是致病菌）入侵或体虚引起，而脾虚泄泻主要由正气虚而外邪入引起。已有学者运用微生态学理论与方法去诠释。中医脾胃理论研究证实，大黄脾虚模型小鼠肠道菌群失调，健脾方药具有一定的调整菌群失调作用［1、2］。健康人体或动物胃肠道存在着庞大的菌库，同脾胃系统乃至整个机体有着实质性的相互依存性。肠道微生态体系在生理状态下对人体具有药物活化、免疫激活、生物拮抗、解毒与营养等功能，而病理状态下则成为内源性感染或耐药性的根源［3～6］。西医各科与微生态学相结合的肠道菌群研究取得了长足进步，中医药与微生态学的结合研究已有起步。为此，探讨健脾止泻药健脾止泻颗粒对苦寒泻下药物及肠道菌群影响的微生态调节作用，为健脾止泻颗粒的药效机制提供了实验依据。由于临床可见部分患者长期应用抗生素，导致肠内菌群失调后长期泄泻，因此选择林可霉素造成抗生素型菌群失调模型，以探讨健脾止泻颗粒是否具有一定的治疗作用。

表4 健脾止泻颗粒对抗生素菌群失调模型小鼠肠道需氧菌的影响±s，n=6）

表4 健脾止泻颗粒对抗生素菌群失调模型小鼠肠道需氧菌的影响±s，n=6）

注：与正常对照组比较：△△P＜0.01，*P＜0.05

组别 剂量（mg/kg）肠杆菌lgCFU/g肠球菌lgCFU/g正 常 对 照 组7.087±0.049 6.510±0.034模 型 对 照 组 6.464±1.036### 5.511±0.031丽 珠 肠 乐 组 6.449±0.061 5.514±0.036健脾止泻颗粒高剂量组 2 6.414±0.088 5.512±0.018健脾止泻颗粒中剂量组 1 6.423±0.055 5.515±0.027健脾止泻颗粒低剂量组0.5 6.418±0.061 5.510±0.048

选用大黄脾虚造模后发现，模型存在显著的微生态失调，所检测的2种肠道厌氧菌均有不同程度的下降。通过健脾止泻颗粒对脾虚小鼠治疗前后的厌氧菌群检测，发现本方对异常下降的2种厌氧菌均有较明显的扶植作用。乳杆菌在治疗后接近或达到正常水平，而双歧杆菌则超过了造模前含量。由此可知，健脾止泻颗粒能通过对异常低下的厌氧菌产生扶植作用，使之与需氧菌的比值达到正常范围，从而恢复微生态平衡。厌氧菌减少是肠道菌群失调的基本改变之一。健脾止泻颗粒对双歧杆菌这一重要的“健康因子”表现出明显的扶植作用。通过扶植益生菌而间接排斥病原菌或条件致病菌，达到扶正祛邪之功效，是微生态调节剂的基本作用途径之一。

［1］任光友，张贵林.四君子汤对动物肠菌失调及正常胃肠功能的药理研究［J］.中成药，2000，22（7）：504-506.

［2］陈海龙，裴德凯，王冬梅，等.多器官功能不全综合征时肠道细菌微生态学改变的实验研究［J］.中国微生态学杂志，1999，11（1）：22-24.

［3］北京师范大学生物系消化生理科研组.中医脾虚动物模型的造模［J］.中华医学杂志，1980，60（2）：83-85.

［4］徐世杰，肖诚，等.实验性脾虚痹证的黏膜免疫学机制研究［J］.中国中医基础医学杂志，2003，（9）：12.

［5］修宗昌，余绍源，尚文璠，等.脾虚证与酶学相关性研究概述［J］.中国中医基础医学杂志，2009，（12）：79.

［6］陈小野.实用中医脾虚证候模型学［M］.北京：北京医科大学中国协合医科大学联合出版社，1993.12-26.

△通讯作者：李丽静。