COPD大鼠气道黏液分泌调控机制及“从肠论治”干预作用＊

钟相根，李宇航，张 前，贾 旭，孙 燕，郑丰杰，谢 华，刘晓辉，王 蔚，祝小惠，周晓卫，田 彦

（北京中医药大学基础医学院，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾病（chronicobstructive pulmonary disease，COPD）以气道不完全可逆性气流受限为特征，气流受限呈进行性发展，与肺对有害气体或有毒颗粒的异常炎症反应有关，可伴有气道高反应性［1］。气道黏液高分泌是气道阻塞的主要因素之一，是目前COPD发病机制研究的热点，认为气道黏液高分泌已成为影响COPD病情和预后的独立危险因素［2］，气管、支气管树杯状细胞化生是黏蛋白的主要来源，也是黏液过度分泌的结构基础。杯状细胞主要分泌黏蛋白5AC（MUC5AC）。目前认为，杯状细胞化生及其MUC5AC基因表达的关键介导环节涉及白介素-13（IL-13）和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）信号传导通路。

本课题组在“肺与大肠相表里”脏腑相关理论指导下，采用气管内注脂多糖和熏烟的复合法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，在观察了“通利大肠”可改善COPD大鼠肺功能、组织病理损伤、氧化应激损伤及可抑制气道黏液高分泌的基础上［3、4］，进一步观察“从肠论治”对COPD大鼠气道黏液分泌信号调控的影响，探讨COPD“从肠论治”的效应机制。

1 材料与方法

1.1 药物

采用清·吴鞠通《温病条辨·卷二》宣白承气汤（生石膏五钱、生大黄三钱、杏仁粉二钱、栝楼皮一钱五分），主要功效宣肺化痰，通腑泄热。按文献进行药量折算后根据药物功效与归经将宣白承气汤拆分为3组：治肺组（生石膏15g，苦杏仁6g，栝楼皮4.5g）、治肠组（生大黄 9g）、肺肠同治组（生石膏15g，苦杏仁 6g，栝楼皮 4.5g，大黄 9g）。

中药全部购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中医药基础理论与关键技术研究中心鉴定均为正品。生药剂量比例按原著换算，依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量，并扩大10倍。各组药物分别以蒸馏水煎煮30min，提取2次，再合并煎液，并将所得药液用双层纱布过滤，水浴加热蒸发浓缩，贮于冰箱中备用。

1.2 动物与分组

清洁级健康 Wistar雄性大鼠，40只，鼠龄10～12周，体重230g±20g，购于北京维通利华实验动物公司，合格证号SCXK（京）2009-0011。动物适应性饲养7d后，采用随机数字表法分组，分为正常组、模型组、治肠组、治肺组、肺肠同治组，每组8只。

各给药组动物，第15～28天每天1次灌胃给予相应药液，正常组及模型组给予等量0.9％生理盐水，连续14d。各组于末次给药后，禁食12h检测相关指标。

1.3 COPD大鼠模型的制作

［5］采用气管注脂多糖加熏香烟方法：在第1天和第14天，用1％的戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1ml注射器注入溶于生理盐水的 LPS 200μl（1mg/ml），然后将大鼠固定板直立旋转，使 LPS能够均匀分布于两肺。正常组注入生理盐水。第2～第28天（第14天除外），将大鼠置入60cm×50cm×40cm熏吸箱内，注入大前门牌过滤嘴香烟烟雾，浓度约5％，每天上午、下午各1 h。检测用力肺活量（FVC）、第 0.3秒用力呼气容积（FEV 0.3）、第0.3秒用力呼气容积与用力肺活量的比（FEV0.3/FVC）、用力中期呼气流速（FEF25-75）、最大呼气中期流速（MMF）、用力最大呼气流速（PEF）等肺功能相关指标。

1.4 仪器与试剂

Light Cycler 2.0实时荧光定量PCR仪（Roche诊断公司）；动物熏吸箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制；18号静脉套管针（马来西亚制造）。脂多糖，LPS，Sigma公司。大前门牌香烟，上海烟草公司，烤烟型，焦油量12mg，烟气烟碱量0.9mg，烟气一氧化碳量14mg。Trizol RNA提取试剂，Invitrogen公司；M-MLV逆转录酶，Promega公司；SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂盒，Roche公司；引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.5 Realtime-PCR法检测气道EGF-R及IL-13 mRNA的表达

总RNA提取：取肺组织约100mg，按照Trizol试剂说明，采用异硫氰酸胍一步法抽提组织总RNA，所提总RNA经1％的琼脂糖凝胶电泳确定其完整性，并经紫外分光光度计检测所提RNA含量（3μg）和纯度（1.8～2.0）。

cDNA合成：分别取3μg总 RNA为模板，在加入Oligo（dT）和M-MLV逆转录酶后以25μl体系在42℃下反应1h合成 cDNA第1链，之后94℃加热3min以灭活逆转录酶。

实时荧光定量PCR扩增：采用SYBR Green I荧光染料技术，在 20μl反应体系中，加入 cDNA 2μl、ddH2O 13μl、SYBR Green 荧光定量 PCR Mix 4μl、引物 1μl：EGF-R：上 游 引 物：5 ＇-CCC AGT CTA TCA CAA TCA GCC-3＇，下游引物：5＇-GCC CTT AAA GAT GCC ATT CG-3＇，扩增产物长度：247bp。IL-13：上游5′-ATC ACA CAA GAC CAG AAG ACT TC-3′，下游5′-AAC TGG GCT ACT TCG ATT TTGG-3′，扩增产物长度：195bp。用 β-actin基因作为内参，β-actin上游引物 5′-GAC ATC CGT AAA GAC CTC TAT GCC-3＇，下游 引 物 5′-CTC TGT GTG GAT TGG TGG CTC TAT-3＇，扩增产物长度：170bp。

反应条件：94℃ 10min、94℃ 10s、54℃ 10s、72℃10s，45个循环。然后做溶解曲线以确认是否是单一峰。反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳确认扩增产物是否符合原设计片段长度。PCR反应及数据采集在LightCycler 2.0系统上进行，记录其循环阈值（CT），每个样品中靶基因的相对 mRNA表达采用相对定量公式 2－ΔΔCT计算，ΔΔCt=实验组（Ct靶基因 －Ctβ-actin）－ 对照（Ct靶基因 －Ctβ-actin）。

1.6 统计学处理

计量资料用均数±标准差表示，采用SPSS 12.0统计软件进行t检验。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能检测结果

与正常组相比，模型组大鼠 FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF 降低，提示模型组气道阻力增加，气流受限。与模型组比较，用大黄通利大肠的治肠组肺功能显著改善。与治肺组比较，增加了治肠的肺肠同治组肺功能改善作用增强。结果已另文发表，见参考文献［3］。

2.2 各组大鼠气道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA的表达

表1显示，模型组大鼠气道 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表达增强，与正常组比较差异有显著意义（P＜0.01），说明COPD大鼠气道杯状细胞化生及黏蛋白高分泌增强。

表1 各组大鼠气道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表达±s）

表1 各组大鼠气道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表达±s）

注：与正常组比较：*P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01；与治肺组比较：※P＜0.01

组 别n EGF-R mRNA IL-13 mRNA正 常 组8 0.240±0.077 0.167±0.051模 型 组 8 2.129±0.287* 2.080±0.624*治 肠 组 8 0.753±0.134# 1.101±0.207#治 肺 组 8 1.156±0.214 0.821±0.233肺肠同治组 8 0.520±0.077※ 0.382±0.124※

治肠组EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表达降低，与模型组比较有显著差异（P＜0.01），提示“从肠论治”能抑制COPD大鼠气道杯状细胞化生及黏蛋白分泌的信号传导通路，减轻气道黏液分泌及气道阻塞，缓解气流受限。

与治肺组比较，加上“从肠论治”的肺肠同治组EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表达降低（P＜0.01）。提示在治肺的基础上增加通利大肠，抑制气道黏液高分泌信号传导作用增强，有利于进一步改善气道通气及肺功能。

3 讨论

杯状细胞化生和黏液过度分泌是COPD气道慢性炎症重要的病理改变，过度分泌的黏液潴留于气道，加重了业已狭窄气道的阻塞，加速了肺功能的下降进程，易导致气道内感染的发生且不易控制，直接导致病情的恶化乃至死亡。近年的临床病理研究也显示，COPD病情恶化死亡患者肺组织基本都可见到小气道黏液的潴留乃至黏液栓的形成，提示小气道黏液潴留是病情恶化的重要形态学基础。气道黏液高分泌的结构基础被认为是上皮杯状细胞的广泛化生和黏膜下支气管腺的肥大，而在小气道，由于缺乏支气管腺增生的结构基础，其黏液高分泌主要由增生、化生的杯状细胞所致。杯状细胞化生的关键介导环节涉及白介素（IL）-13和表皮生长因子（EGF-R）受体［6～8］。

正常气道上皮接触环境刺激物，可产生炎症/免疫反应介质，一些介质有促分泌功能，激活表面杯状细胞分泌黏蛋白，一些介质可上调黏蛋白基因转录。上调黏蛋白基因转录是持续黏蛋白生物合成和高分泌所必需的过程。杯状细胞主要分泌 MUC5AC。IL-13是体内有力的黏液刺激物，IL-13引起大鼠气道上皮MUC5AC表达上调，除了IL-4受体途径外，同时有EGFR表达的增强，给予EGFR酪氨酸激酶抑制剂BBX1522可抑制 MUC5AC表达，表明IL-13引起气道黏液高分泌也通过EGFR途径。此外，IL-13也可直接驱动黏蛋白基因表达。许多细胞因子制作的黏液高分泌气道炎症模型均通过产生IL-13来实现。研究显示，TH2细胞缺乏IL-13不能刺激产生黏液，而EGFR信号传导通路是众多刺激因子如吸烟、过敏原、氧化应激、细菌感染、细胞因子等诱导MUC5AC基因表达的共同通路。

本课题组以往研究发现，“通利大肠”可抑制COPD大鼠气道黏液高分泌，但其影响黏液分泌的调控机制还有待深入研究。因此，本实验选用宣白承气汤，进一步拆方观察其治肺组、治肠组及肺肠同治组对COPD大鼠气道黏液分泌信号调控机制的影响，并着重对比分析增加“从肠论治”因素对此的干预作用。

实验结果显示，与正常组相比，COPD组大鼠气道EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表达增强，提示模型组大鼠气道杯状细胞化生及黏蛋白表达增强。与模型组比较，用大黄“从肠论治”的治肠组 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表达降低。与治肺组比较，增加了治肠的“肺肠同治”组抑制气道杯状细胞化生及黏蛋白表达信号传导作用。因此，通利大肠或在治肺的基础上增加通利大肠，均能增强抑制 COPD大鼠气道气道杯状细胞化生及黏液高分泌信号调控的作用，从而进一步改善气道通气及肺功能。

综上所述，通过“从肠论治”通腑宣肺，抑制COPD气道上皮杯状细胞化生及黏液高分泌信号传导，进而抑制黏液高分泌，改善气道阻塞及减少病原菌定植，这可能是“通利大肠”改善COPD大鼠肺功能的效应机制之一，有助于进一步探讨肺肠之间效应互动的联络机制。

参考文献：

［1］WEISS ST.What genes tell us about the pathogenesis of asthma and chronic obstructive pulmonary disease［J］.Am J Respir Cirt Care Med，2010，181（11）：1170-1173.

［2 ］Steiger D，Fahy J，Boushey H，et al.Use of mucin antibodies and cDNA probes to quantify hypersecretion in vivo in human airways［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，1994，10：538-545.

［3］李宇航，钟相根，贾旭，等.“通利大肠”对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺功能及血气的影响［J］.北京中医药大学学报，2010，33（7）：452-455.

［4］李宇航，钟相根，贾旭，等.“通利大肠”对慢性阻塞性肺疾病模型大鼠氧化应激的影响［J］.中华中医药杂志，2010，25（8）：28-30.

［5］李宇航，黄颖，郭明章，等.清热解毒药物配伍桔梗对 COPD大鼠模型病理形态的影响［J］.北京中医药大学学报，2008，31（12）：819-822.

［6］文秀芳，周向东.气道上皮杯状细胞化生和分泌调控［J］.国际病理科学与临床杂志，2008，28（1）：59-63.

［7］Zhen G，Park SW，Nguyenvu LT，et al.IL213 and epidermal growth factor receptor have critical but distinct roles in epithelial cell mucin production［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2007，36（2）：244-253.

［8］Tyner JW，Kim EY，Ide K，et al.Blocking airway mucous cell metaplasia by inhibiting EGFR antiapoptosis and IL213 transdiffer2entiation signals［J］.J Clin Invest，2006，116（2）：309-321.

△通讯作者：李宇航，医学博士，教授，主任医师，博士研究生导师，从事中医辨证论治规律研究。北京市朝阳区北三环东路11号北京中医药大学基础医学院，邮编：100029，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn。