益气方干预化疗所致免疫功能低下作用机理的研究＊

苏 颖，郭 焱，朱 娜，顾红缨，李春子

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

恶性肿瘤发病率呈逐年增高趋势，手术和放化疗成为肿瘤的主要治疗手段，CY是目前应用最广泛的烷化剂类抗肿瘤药，通过影响肿瘤细胞的生长繁殖而达到治疗目的，但包括CY在内的化疗药物极易引起造血系统和免疫系统的损伤，影响恶性肿瘤的治疗效果［1、2］。

肿瘤患者术后化疗造成的毒副作用严重影响术后治疗与康复，特别是血中WBC等明显减少对机体免疫机能产生严重影响，因此，采取有效措施防治化疗的毒副反应，越来越引起广泛关注。而中药能够提高化疗患者机体免疫力，对血中WBC等的生成有较好的促进作用，其研究已引起医学界的重视［3～5］。

中药对化疗所致血中WBC等减少的治疗研究，近年来取得了一定的进展，但是治疗进展比较缓慢，虽有相关报道，但均处于探索阶段［6～8］。

恶性肿瘤患者常伴有不同程度的正气虚弱，免疫力较正常人低下，加之术后化疗后，免疫力严重低下，血中红WBC等数量严重不足，直接影响肿瘤术后治疗及预后恢复。此种情况，运用中医学理论辨证，虽属气血两虚，但重在气虚，气虚不能生血为其机理关键。许多研究资料表明，气血不足尤其气虚与免疫功能的表达与调节有着重要关系［9、10］。

1 材料与方法

1.1 材料

ICR小鼠体重18g～22g，雌雄各半，由本校基础实验中心提供。益气方是根据药典配方调配，按汤剂常规煎药、过滤。各饮片由本校附属医院提供。环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司产品；EDTA-2Na，北京鼎国生物技术有限责任公司生产；小鼠GCSF试剂盒为美国BD公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 取ICR小鼠，随机分为模型组、空白对照组、益气方高、中、低剂量组，每组10只小鼠，雌雄各半。实验环境条件符GB1495-94国家标准，室温19℃ ～21℃，相对湿度40％ ～60％，每日光照12h，自由进食饮水。

1.2.2 模型建立 给药第8天开始给模型组、益气方高、中、低剂量组小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg·kg－1，连续 3d。

1.2.3 分组给药 给药组小鼠按剂量分别灌胃给药，各组给药剂量均按小鼠临床等效量计算所得。空白对照组与模型组小鼠同时灌服等容量生理盐水，连续15d，给药体积为30ml/kg体重，每日给药1次。从第8天起模型组与给药组小鼠腹腔注射环磷酰胺80mg·kg－1，连续3d，正常组小鼠同时注射等体积生理盐水。

1.2.4 小鼠WBC水平的测定 于第15天末次给药20h后小鼠行鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝剂抗凝，上全自动血液分析仪分析WBC水平。

1.2.5 淋巴细胞转化实验（MTT法）小鼠脾细胞悬液的制备：将小鼠颈椎脱臼处死，无菌分离小鼠脾脏，置于预冷PBS中200目尼龙网研磨过滤，收集细胞，冷PBS离心（250g，5 min）洗涤细胞2次，再重悬于IMDM培养液，调整细胞密度为5×106/ml。

ConA诱导小鼠淋巴细胞增殖：将中细胞接种于96孔板，每孔200μl，分别设置对照组（只加入脾细胞和IMDM）以及不同浓度ConA刺激下的实验组（分别加入 ConA20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml及脾细胞和 IMDM），每组含 5个复孔，孵育 42h。加入MTT5mg/ml，CO2孵育箱 6h。每孔加二甲基亚砜，充分震荡，37℃孵育1h。570nm波长酶标仪下测OD值，计算结果。SI（刺激指标）=OD加样孔/OD对照孔

1.2.6 小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的测定 用ELISA法检测小鼠外周血G-CSF水平，小鼠眼球取血，离心30min分离血清，放置 －20℃冰箱保存，进行小鼠粒细胞集落刺激因子的酶联反应。

1.2.7 统计学分析 实验数据用SPSS软件进行方差分析两两比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对小鼠WBC的影响

通过实验表明，注射环磷酞胺后小鼠的WBC显著低于正常小鼠，表明其处于免疫抑制状态。注射环磷酰胺并灌服益气方的小鼠粒细胞数较模型组小鼠有明显提高，尤以给予益气方中剂量组，增加显著，且达到正常对照水平（图1）。提示益气方可以抵消环磷酞胺引起的WBC减少症状及细胞免疫损伤，增强免疫损伤小鼠细胞的应答能力，对机体低下的细胞免疫具有一定的恢复作用。

图1 小鼠粒细胞水平检测

2.2 对淋巴细胞增殖的影响（MTT法）

OD值换算成刺激指数后，将模型组与空白组比较，P＜0.05，提示造模成功；高剂量组与模型组比较P=0.25＞P0.05，没有统计学意义；中、低剂量组与模型组比较，结果P＜0.05，皆有统计学意义（图2），说明中、低剂量给药即可促进淋巴细胞的增殖。

2.3 对小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）的影响

实验结果证明，模型组与空白组比较，有显著性意义，即造模成功；益气方高、中、低剂量组小鼠的G-CSF明显回升，已达正常，与环磷酰胺模型组比较差异有显著意义，高、中、低剂量进行组间比较得，益气方中剂量治疗组差异显著性最大（图3），提示益气方对CY化疗小鼠所致的G-CSF减少有缓解作用，并能提高G-CSF水平，提高机体的免疫力。

图2 淋巴细胞增殖结果

图3 小鼠粒细胞集落刺激因子（G-CSF）含量

3 讨论

CY是临床广泛应用于恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤等恶性肿瘤的烷化剂抗肿瘤药物，属于细胞周期非特异性的烷化剂［11］，对整个周期中的细胞均具有杀灭作用，对肿瘤细胞和正常细胞无选择性，在诱导肿瘤细胞生长繁殖，导致肿瘤细胞死亡和坏死，同时也能杀伤正常的组织细胞，从而对全身多种组织器官产生损伤，尤其是生长旺盛的骨髓造血细胞，因此CY很容易引起骨髓抑制，造血抑制。此外，CY也能对造血微环境造成不可逆性损伤，从而导致感染等后果，影响恶性肿瘤的治疗效果［12、13］。本实验中模型组小鼠血清G-CSF水平明显下降，推测其原因可能为CY鼠化疗造成机体广泛性损伤而引起，而G-CSF活性的降低可能与骨髓抑制和白细胞减少，淋巴细胞转化减少的原因之一。

益气方汤剂主要成分为黄芪、当归、鹿茸、阿胶、川芎、芍药，具有益气固表、补血活血之功。鹿茸增加鼠脊神经组织的氧消耗，使呼吸商值增加，促进糖酵解，对CY所致免疫功能低下小鼠的巨噬细胞吞噬功能均有刺激作用，对T淋巴细胞的激活有显著作用［14］。人参明显增加巨噬细胞的吞噬功能，对脾脏具有明显的增重作用，是良好的强壮滋补药。人参能促进淋巴母细胞的转化，作用于淋巴细胞的分化成熟过程而提高T、B淋巴细胞对分裂原的反应。适当浓度人参皂甙可明显促进淋巴细胞的有丝分裂，刺激小鼠网状内皮系统的吞噬功能及促进补体和抗体的生成，对特异性免疫和非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫均有影响［15］，有利于机体增强免疫监视功能，抑制癌瘤细胞的核酸代谢及“封闭抗体”的形成。黄芪能提高免疫功能低下小鼠NK细胞活性，对CY化疗所致的 CD3、CD4和 CD8低下能升高至接近正常。通过促进IL-2的产生而促进而改善免疫细胞的功能［16］。芍药是活血化瘀的代表药之一，与CY合用对S180和L615具有明显的协同作用。

综上所述，上述6味中药组成的益气方，能上调CY化疗所致的免疫功能低下，改善免疫细胞的功能，提高机体免疫力。其中，中剂量治疗组组效果最为显著，高剂量治疗组次之，低剂量治疗组效果再次之，有关机制尚需进一步研究阐明。

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