白藜芦醇抗氧化应激效应对大鼠脊髓损伤组织的保护

王广生 王 菲 强 辉 强 杰 陕西省宝鸡市华山医院骨科(宝鸡 721000）

白藜芦醇抗氧化应激效应对大鼠脊髓损伤组织的保护

王广生 王 菲△强 辉▲强 杰 陕西省宝鸡市华山医院骨科(宝鸡 721000）

目的:探讨白藜芦醇对大鼠急性脊髓损伤的保护作用及作用机制。方法:48只大鼠随机分为假手术组、模型组和白藜芦醇干预组 ,每组 16只。术后 6h、12h评定各组大鼠神经功能,检测脊髓组织 MDA、SOD的含量,ELISA法检测各组大鼠血清 TNF-α及 IL-6表达。结果:术后 6h、12h白藜芦醇治疗组神经功能较模型组显著提高。模型组脊髓组织 MDA含量显著高于假手术组(P＜0.05）,SOD显著低于假手术组(P＜0.05）;术后 6h、12h模型组 TNF-α及 IL-6水平显著高于假手术组(P＜0.05）。白藜芦醇组 MDA含量显著低于模型组(P＜0.05）,SOD水平显著高于模型组(P＜0.05）;白藜芦醇治疗组 TNF-α及IL-6水平显著降低于模型组 (P＜0.05）。结论:白藜芦醇可能通过降低急性脊髓损伤后的氧化应激水平,减轻脊髓炎症程度而发挥对其保护作用。

脊髓损伤是涉及多因素、累及多个环节,导致脊髓组织细胞损伤、脊髓间质水肿和出血的一种急性创伤性疾病。氧化应激是在机体内活性氧生成和抗氧化物质失衡状态下,直接或间接通过信号转导通路引起细胞的损伤,是许多疾病的病因,通过抑制氧化应激的发生可以有效的抑制疾病的发生发展[1～3]。近年来研究表明,氧化应激机制在脊髓损伤的发病中发挥重要作用,与脊髓炎时脊髓及脊髓外器官的损伤有密切的联系[4,5]。白藜芦醇是白藜芦醇块根的主要有效成分,含量较其他组分高、结构稳定、容易获得。研究表明,RES具有较强的抗氧化作用,成为正在开发的新一代抗氧化应激植物药[6～8]。本研究利用大鼠脊髓损伤模型,观察 RES对脊髓组织氧化应激的抑制作用,为 RES的临床应用奠定实验基础。

1 材料与方法1.1 实验动物与材料 取体重 280～320g清洁级健康雄性 SD大鼠 48只,由西安交通大学基础医学院动物实验中心提供并代为饲养。所有动物实验遵循我国动物研究委员会的条款并依照美国关爱和使用动物健康研究院的准则进行(NationalInstitutesofHealthpublicationNO.96-23,revised1996）。丙二醛 (MDA）、超氧化物歧化酶 (SOD）试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。血清 TNF-α及 IL-6 ELISA法检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。

1.2 方法 1.2.1实验动物分组及脊髓损伤模型制备:48只 SD大鼠随机分为假手术组、脊髓损伤模型组、白藜芦醇治疗组,每组 16只。假手术组,仅行手术暴露,不给予打击及治疗;脊髓打击伤组,脊髓打击损伤后给予等量生理盐水作为对照;白藜芦醇治疗组于术后即刻腹腔注射 RES(200mg/kg）。脊髓损伤模型制备如下所述:大鼠禁食 12h,禁水 4h,戊巴比妥钠(1.2mg/kg）腹腔注射麻醉。腹腔麻醉后,俯卧位固定,胸背部剃毛备皮 ,碘伏消毒皮肤,铺一次性无菌单。以 T8棘突中心作长约 3cm切口暴露硬脊膜 ,用自制改良的 Allen装置制备脊髓急性打击伤动物模型,损伤力度为 25gcm(10g× 2.5cm）。造成大鼠脊髓不完全损伤,致伤后迅速移开打击物,0号线逐层缝合。模型成功的判定标准:打击后 ,损伤处脊髓出血、水肿,大鼠出现摆尾反射,双下肢及躯体回缩样扑动,麻醉清醒后双下肢呈弛缓性瘫痪。术后即刻给予青霉素注射液 5万 u背外侧肌群肌注预防感染 ,每天 1次 ,持续 3d。注意保温,分笼饲养,自由取食。每天更换一次垫料保持干燥,每日膀胱按摩两次致自主排尿反射建立。组中动物如死亡,随时补充。

1.2.2 神经功能评估:采用 BBB(theBassoBeattie Bresnahanlocomotorratingscale,BBB）分级法,各组动物在术后 6h,12h评估后肢运动功能。评分标准:第一部(0-7分 ）评判动物后肢各关节活动;第二部(8-13分 ）评判动物后肢的步态和协调功能;第三部(14-21分）评估动物运动时爪子的精细运动,三项满分 21分。采用双盲法,每次评分由经培训后的两个非本实验人员分别独立完成,数据以平均值±标准差表示。

1.2.3 脊髓组织 MDA、SOD检测:术后 6h,12h,大鼠戊巴比妥钠麻醉后取脊髓组织,称重后加入相应比例的生理盐水,用低温匀浆机制成 100g/L的组织匀浆,在-10℃,3500r/min离心 20min,于-20℃保存待测。根据 MDA、SOD测定试剂盒中说明书的步骤进行 SOD、MDA测定。

1.2.4 血 TNF-α及 IL-6检测:术后 6h,12h,大鼠戊巴比妥钠麻醉后将各组实验大鼠开胸,迅速从心脏抽血 2mL,静置30min后 ,4℃ ,3000r/min离心 10min(离心半径 8cm）,取上清,血 TNF-α及 IL-6应用晶美生物工程有限公司提供的ELISA检测试剂盒检测,详细步骤严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3 统计学分析 采用 SPSS11.0软件进行统计处理,计量资料数据以±s表示,组间比较采用方差分析,检验水准为双侧 α=0.05。

2 结 果2.1 神经功能评估 BBB评分结果如表 1显示 SCI后假手术组评分变化近似于正常值,无明显改变。在同一时相点,其他两组较假手术组呈显著性差异(P＜0.05）。白藜芦醇治疗组与模型组比较有显著性差异(P＜0.05）。

表1 脊髓损伤后 6h、12hBBB神经功能评分

2.2 术后各组大鼠脊髓组织 MDA和 SOD的水平 术后 6h、12h模型组脊髓组织中 MDA含量显著高于假手术组(P＜0.05）,SOD水平显著低于假手术组(P＜0.05）;白藜芦醇组MDA含量显著低于模型组(P＜0.05）,SOD水平显著高于模型组 (P ＜ 0.05）。 (见表 1）。

表1 各组大鼠脊髓组织 MDA、SOD含量的比较(±s）

表1 各组大鼠脊髓组织 MDA、SOD含量的比较(±s）

注:同时间点与假手术组比较 ,△P＜0.05;同时间点与模型组比较,▲P＜0.05

组 别 时间点(h）MDA(nmol/mg）SOD(U/mg）假手术组 6 12 5.9±0.4 5.9±1.2 151.2± 9.6△143.7± 7.4△白藜芦醇治疗组 6 12 523.1±12.3 533.6±10.9模型组 6 12 32.4± 1.6△36.5± 2.1△22.1± 0.8△▲25.3± 1.0△▲276.4± 18.6△▲288.3± 15.3△▲

2.3 术后各组大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平 术后 6h、12h模型组血清 TNF-α及 IL-6水平均显著高于假手术组(P＜0.05）;白藜芦醇组血清 TNF-α及 IL-6水平显著降低于模型组(P＜0.05）,但白藜芦醇组血清淀粉酶水平仍显著高于假手术组(P ＜0.05）(见表 2）。

表2 各组大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平比较 (±s）

表2 各组大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平比较 (±s）

注:同时间点与假手术组比较,△P＜0.05;同时间点与模型组比较,▲P＜0.05

组 别 时间点(h）TNF-α(ng/L）IL-6(ng/L）假手术组 6 12 10.32±0.87 10.68±0.42 49.68± 1.25△55.68± 0.89△白藜芦醇治疗组 6 12 8.11±0.46 8.34±0.14模型组 6 12 69.04± 0.61△79.68± 0.56△36.23± 0.97△▲30.57± 0.65△▲35.36± 0.77△▲32.29± 4.22△▲

3 讨 论脊髓损伤的机制尚未完全阐明,目前研究表明,氧化应激在其发生中发挥重要作用。目前认为,氧自由基(oxygenfreeradical,OFR）在脊髓损伤发病过程中大量产生,OFR对机体的损害可能起着一种扳机样作用,钙超负荷是细胞损害的一条最终的共同途径[9]。SOD是催化超氧阴离子歧化反应的酶类,细胞内主要的抗氧化酶和自由基清除剂,能保护细胞、对抗氧自由基的侵害[10],其水平的高低,表明其保护组织细胞免受毒性氧自由基损伤的效能强弱。MDA是脂质过氧化的最终产物,测定 MDA可直接反映自由基水平,其含量高低是组织细胞损伤的重要标志[11]。通过 MDA含量和 SOD活性的测定可以间接反映体内抗氧化系统的能力。通过我们实验发现,术后 6h、12h模型组脊髓组织中 MDA含量显著高于假手术组,SOD水平显著低于假手术组,说明氧化应激机制参与了脊髓损伤的发病过程。当应用白藜芦醇后,MDA含量则显著低于模型组,SOD水平显著高于模型组,神经功能评分明显提高,表明白藜芦醇能够有效抑制氧化应激而发挥其对脊髓损伤的保护作用。

脊髓损伤后的炎症反应是引起脊髓继发性损伤的重要因素。 肿瘤坏死因子 (TNF-α）、白细胞介素 -1β (IL-1β）、白细胞介素-10(IL-10）、髓过氧化物酶 (MPO）等炎症因子可刺激其他细胞因子和炎症介质的产生,这些细胞因子还可作为内皮细胞活化的信号,刺激细胞粘附分子的产生及白细胞-内皮细胞粘附,诱导白细胞向损伤区浸润。白细胞浸润破坏血脑屏障,进一步加重脊髓损伤后脊髓损伤。实验结果显示,术后 6h、12h模型组血清 TNF-α及 IL-6水平均显著高于假手术组;提示中性粒细胞浸润及细胞因子的表达上调参与了脊髓损伤发生发展过程。而应用白藜芦醇后大鼠血清 TNF-α及 IL-6水平显著降低于模型组,表明白藜芦醇能够通过降低大鼠脊髓损伤后脊髓组织中TNF-α及 IL-6水平,减轻脊髓组织中性粒细胞浸润及细胞因子表达,减轻损伤后脊髓组织内过度的炎症级联反应,发挥其保护作用。

我们的研究表明,利用白藜芦醇治疗脊髓损伤后大鼠运动神经元的功能得到较好恢复。研究结果证实白藜芦醇对大鼠急性脊髓损伤具有保护作用,其部分机制可能与白藜芦醇能够降低脊髓组织氧化应激水平、提高抗氧化酶活力、恢复脊髓组织内氧化与抗氧化动态平衡、减少中性粒细胞浸润及促炎细胞因子合成有关。

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脊髓损伤 /中医药疗法 白藜芦醇 /分析 大鼠 实验研究

R28

A

1000-7369(2011）01-0111-03

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▲陕西省人民医院骨科(西安 710068）

(收稿 2010-08-09;修回 2010-09-12）