高效液相色谱法同时测定枣仁安神胶囊中7种木脂素类成分

许慧君， 吉 祥， 张兰桐*， 钟 颖， 易 自

(1．河北医科大学药学院药物分析教研室，河北石家庄050017;2．河北石家庄乐仁堂制药有限责任公司，河北石家庄050000)

枣仁安神胶囊来源于中华人民共和国卫生部药品标准《中药成方制剂》11册［1］(标准编号:WS3-B-2164-96)。枣仁安神胶囊是以酸枣仁(炒)、丹参、五味子(醋炙)等药味制成内服的制剂，具有补心养肝，安神益智功效，用于神经衰弱患者心肝血虚证引起的失眠，兼有头晕、健忘等功效。方中五味子性味酸、温，归入肺、肾、心经，具有敛肺滋肾、生津敛汗、宁心安神之功效，与酸枣仁配伍用于心悸怔忡及失眠［2-6］。目前文献报道仅对枣仁安神胶囊中单一成分进行质量控制［7-12］。故测定五味子中多个木脂素类有效成分的量对于枣仁安神胶囊的质量控制具有非常重要的意义。本研究采用高效液相色谱法测定了枣仁安神胶囊中7种木脂素类成分，进一步为枣仁安神胶囊的质量控制提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1200液相色谱仪(美国Agilent公司);BP211D型电子分析天平(德国Satrorius公司)。乙腈、甲醇(色谱纯，美国Tedia公司);水为重蒸水。对照品由复旦大学药学院提供。枣仁安神胶囊购于贵州同济堂制药有限公司。

2 方法与结果

2．1 色谱条件 色谱柱为 Brava BDS C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:A 相为乙腈，B 相为水;柱温:30℃;体积流量:0．8 mL/min;检测波长:225 nm;进样量:20 μL;线性梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Tab．1 Gradient elution program

2．2 对照品溶液的制备 分别称取对照品戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素适量，精密称定，加甲醇分别制成约1 mg/mL的对照品溶液。分别取各对照品适量加甲醇制成适当质量浓度的混合对照品贮备液，摇匀，0．45 μm 滤膜滤过，备用。

2．3 供试品溶液的制备 取重量差异项下的枣仁安神胶囊内容物1．0 g，精密称定，加甲醇溶解，并定容于25 mL量瓶中，称定质量，超声处理30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补充所失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，离心，0．45 μm 滤膜滤过，弃去初滤液，续滤液作为供试品溶液。

2．4 阴性溶液的制备 按处方比例制备缺五味子的阴性空白样品，，并按2．3项下方法制成阴性样品溶液。

2．5 方法专属性考察 分别精密吸取前述混合对照品溶液、供试品溶液与阴性供试品溶液各20 μL，按2．1项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素与其它峰分离度均大于1．5，分离度良好，各对照品对应色谱峰理论塔板数大于2 000，不受其他组分的干扰。

2．6 线性关系考察 精密量取对照品贮备液1．0、2．0、4．0、6．0、8．0 mL 置 10 mL 量瓶中，分别加甲醇稀释至刻度。精密吸取20 μL，注入液相色谱仪测定。以质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。回归方程，线性范围及相关系数见表2。

2．7 精密度试验 精密吸取同一混合对照品溶液各20 μL，连续进样5次，记录色谱峰的峰面积。结果戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD值分别为 0．59%、0．85%、0．64%、0．81%、0．68%、0．92%和0．48%，均符合精密度试验的要求，说明该方法的精密度良好。

图1 对照品(A)，枣仁安神胶囊(B)和阴性样品(C)的HPLC色谱图Fig．1 HPLC chromatograms of reference substances(A)，Zaoren Anshen Capsules(B)and negative samples(C)

表2 7种有效成分的回归方程、相关系数和线性范围Tab．2 Regression equations，correlation coefficient and linearity ranges of the seven compounds

2．8 重复性试验 取枣仁安神胶囊5份，每份精密称取内容物约1．0 g，按2．3项下方法制备供试品溶液，进样20 μL进行测定。结果戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素质量分数平均值(n=5)分别为1．651、2．247、0．732、0．877、0．433、5．710、0．941 mg/g;RSD 值分别为 0．62%、0．59%、0．48%、0．83%、0．74%、0．68% 和 0．55%。均符合规定，表明本方法重复性良好。

2．9 稳定性试验 取同一枣仁安神胶囊供试品溶液分别于 0、4、8、12、18、24 h 进样分析，记录峰面积。戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的RSD值分别为 0．67%、0．52%、0．86%、0．73%、0．70%、0．62%和0．59%。结果表明供试品于溶液室温条件下放置24 h稳定性良好。

2．10 回收率试验 精密称取2．9项下已测定的枣仁安神胶囊内容物0．5 g，共6份，分别精密加入对照品适量，按2．3项下方法操作，制备供试品溶液并进样分析。结果戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的平均回收率分别为 99．50%、99．95%、99．72%、99．78%、100．51%、99．93% 和 99．23%。RSD 值分别为 0．80%、0．57%、1．35%、0．73%、1．27%、0．26%和0．93%。结果表明该方法回收率良好，见表3。

2．11 样品测定 取3批枣仁安神胶囊，按2．3项下制备供试品溶液，按上述方法进行测定，记录色谱峰面积，将样品中7种木脂素的峰面积代入相应标准曲线，分别计算戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素的质量分数。每批样品测定3份，结果见表4。

表3 7种成分加样回收率考察结果Tab．3 The results of recovery

表4 枣仁安神胶囊中7种有效成分测定结果(n=3)Tab．4 The contents of the seven compounds in Zaoren Anshen Capsules(n=3)

3 讨论

本研究建立了HPLC-DAD法同时测定枣仁安神胶囊中7种木脂素类成分，其分别为戈米辛H、五味子醇甲、五味子醇乙、戈米辛F、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素。在该色谱条件下7种有效成分均能完全分离，阴性溶液无干扰，经精密度、重复性、回收率试验证明该方法简便、快捷，准确度较好且灵敏度高，可以为枣仁安神胶囊的质量控制提供科学依据。

流动相选择中，考察了甲醇-水、乙腈-水等条件，结果乙腈-水作为流动相对多个木脂素类成分的洗脱较为理想，再一系列的摸索，确定梯度洗脱条件后，各有效成分保留时间均在65 min内，并且各色谱峰分离度较好，理论塔板数较高。由于本研究中待测组分均为木脂素类成分，结构较为相近，化学性质也进而相近。故在检测波长的选择中，以各成分共同的最大吸收波长225 nm为检测波长。

本研究中对枣仁安神胶囊的提取方法进行了考察，采用了加热回流和超声提取。经比较，结果表明超声提取所需溶剂量少、时间短并且提取效率高。从而对超声提取中的各个影响因素进行考察，包括溶剂的选择、溶剂的量以及提取时间的影响。最终确定其提取条件为90%乙醇作为溶剂，固液比为1∶25(g/mL)，最佳提取时间为30 min。

［1］WS3-B-2164-96 卫生部颁药品标准中药成方制剂第11册［S］．2005:162．

［2］刘 勇，南达元．枣仁安神胶囊治疗心理生理性失眠的临床观察［J］．中国中药杂志，2009，34(13):1730．

［3］祝连生，谭 倩，武 锋．枣仁安神胶囊辅助治疗脑卒中后抑郁症［J］．浙江中西医结合杂志，2007，17(8):463-464．

［4］郭彦蕊，王晓光．枣仁安神汤治疗失眠［J］．中国民间疗法，2009，17(11):70．

［5］张卫同，施振国，孙 艳．枣仁安神胶囊治疗心脾两虚型失眠症32例［J］．临床医药，2007，16(19):58．

［6］吴敦煌，周虎珍，邵鲁承．枣仁安神汤治疗失眠37例［J］．现代中西医结合杂志，2005，14(18):2440-2441．

［7］谭晓虹，王志宝，赵 倩．HPLC测定南、北五味子中五味子甲素和五味子乙素的含量［J］．中成药，2010，32(1):155．

［8］丁伟杰，白敦耀，刘 伟．枣仁安神颗粒的质量标准考察［J］．中国医院药学杂志，2007，27(9):1305-1306．

［9］王桂蓉，李 根，成 志，等．HPLC法测定枣仁安神颗粒中丹酚酸B的含量［J］．华西医学，2009，24(6):1500-1502．

［10］冯 华，张超云，邹孔强．HPLC色谱法测定枣仁安神片中五味子醇甲的含量［J］．中医药导报，2009，15(1):82-83．

［11］刘凤兰，刘 安，王 洋，等．枣仁安神液质量控制方法研究［J］．中国实验方剂学杂志，2006，12(8):19-20．

［12］韩 冰，毕丽娟．RP-HPLC法测定枣仁安神颗粒中丹参素的含量［J］．黑龙江医药，2009，22(6):777-778．