沙棘总黄酮对人脐静脉血管内皮损伤细胞增殖及细胞周期的影响

苑 博,张 放,程嘉艺,康廷国

(辽宁中医药大学,沈阳 110032)

近年来研究证实,沙棘总黄酮具有抑制血小板聚集防止血栓发生、扼制动脉粥样硬化等作用[1]。血管内皮细胞是覆盖于血管内表面的单层细胞,直接与血液各种成分接触,具有多种生物学功能。在多种病理因素作用下,血管内皮细胞易发生结构损伤和功能障碍,目前用于多种疾病机制的研究[2]。2010年 10月,我们观察了沙棘总黄酮对过氧化氢

＊通讯作者(H2O2)损伤的人脐静脉血管内皮细胞增殖及细胞周期的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 沙棘总黄酮,人脐静脉血管内皮细胞株(CRL-1730,ATCC公司),丹参注射液,DMEM培养基、胰蛋白酶,碘化丙锭,胎牛血清,四氮唑兰(MTT)、二甲基亚砜。VS-840-KU洁净工作台, HERAcell150 CO2培养箱,CKX41倒置显微镜。ST-2冷冻离心机,SUNRISE RC酶标仪,FACSCalibur流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将CRL-1730培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中,其中含青霉素(100 U/ m l)和链霉素(100 mg/L),置于37℃、5%CO2培养箱中,每24 h换液1次。

1.2.2 细胞损伤模型制作及干预 将CRL-1730细胞密度调整至 5×104/ml,接种至96孔板中,每孔200μl,在上述条件下培养 24 h随机分为四组,正常组不干预;模型组加入250μmol/L H2O2;沙棘组加入沙棘总黄酮终浓度分别为50、100、200μg/m l,继续培养24 h后加入H2O2(剂量同上);丹参组加入丹参注射液终浓度2.5 mg/m l,继续培养24 h后加入H2O2(剂量同上),除正常组外,其余各组均H2O2刺激细胞4 h。

1.2.3 细胞活性检测 取1.2.2细胞,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,37℃孵育4 h,倾去上清液,每孔加二甲基亚砜150μl,低速振荡10 min,使蓝紫色结晶甲瓒充分溶解,在全自动酶标仪上于490 nm处测定吸光度值(A值)。

1.2.4 细胞周期检测 将1.2.1的细胞密度调整至3×105/ml,接种至6孔板,每孔2 ml,参照1.2.2进行细胞分组与处理。0.25%胰蛋白酶消化细胞,将细胞收集于EP管中,800 r/min,离心5 min,加预冷PBS洗2次,每次1m l,加预冷的终浓度为70%的乙醇4℃避光固定过夜,800 r/min离心5min,去上清;PBS清洗2次;重悬细胞于500μl含100μg/ m l RNase的PBS缓冲液中,避光37℃孵育30 min,加PI溶液1 ml,4℃避光30 min,上机检测。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件,计量数据以±s表示,组间比较行t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组 CRL-1730细胞活性比较见表 1,各组CRL-1730细胞周期比较见表 2。

3 讨论

血管内皮细胞的正常功能是保持通畅的血液循环,维持正常的血管舒缩状态,防止血小板聚集和血栓形成,维持内皮细胞的分泌功能,血管内皮细胞结构和功能损伤与动脉粥样硬化的发生和发展密切相关,是造成动脉粥样硬化的始动因素[3]。活性氧自由基是内皮细胞损伤的主要原因之一,而H2O2是活性氧,可促进自由基生成。生物体内 H2O2如不及时消除可透过细胞膜,在膜外与Fe或Cu生成羟自由基,从而引发脂质过氧化而导致细胞损伤,最终形成动脉粥样硬化斑块。因此抑制血管内皮细胞氧化损伤对动脉粥样硬化和冠心病等疾病的防治具有重要意义[4]。

表1 各组CRL-1730细胞活性比较(n=6,±s)

表1 各组CRL-1730细胞活性比较(n=6,±s)

注：与正常组比较,＊P＜0.01;与模型组比较,△P＜0.05,﹟P＜0.01

组别 A值沙棘组200μg/ml 0.507±0.018﹟100μg/ml 0.488±0.012△50μg/ml 0.459±0.030丹参组 0.486±0.012△模型组 0.459±0.027＊正常组 0.522±0.017

表2 各组CRL-1730细胞周期比较(n=3,%,±s)

表2 各组CRL-1730细胞周期比较(n=3,%,±s)

注：与正常组比较,＊P＜0.05,△P＜0.01;与模型组比较,﹟P＜0.05

组别 G0/G1 S G2/M沙棘组200μg/ml 66.30±1.44﹟ 28.55±0.54﹟ 5.16±0.33﹟100μg/ml 76.38±1.01﹟ 20.10±0.47﹟ 3.52±0.53﹟50μg/ml 75.81±0.98﹟ 23.50±0.55﹟ 0.69±0.28丹参组 75.65±1.11﹟ 20.50±0.45﹟ 3.85±0.62﹟模型组 82.23±1.22 11.77±0.74△ 1.91±0.25＊正常组 83.19±0.99 15.76±0.63 1.05±0.24

近年研究已证明MTT法可用于研究血管内皮细胞的活性,而血管内皮细胞的活性可反映细胞的代谢与增殖情况[5]。本研究发现,250μmol/L H2O2使CRL-1730的细胞活性降低,而沙棘总黄酮干预后则细胞活性升高,说明沙棘总黄酮具有抗 H2O2损伤作用。本研究沙棘高剂量组和丹参组的细胞周期变化趋势相同,主要表现为G0/G1期细胞比例降低,S期细胞比例增加,G2/M期细胞比例亦有所上升。提示沙棘总黄酮及丹参均可提高细胞分裂增殖指数,250μmol/L H2O2损伤的模型组S期细胞比例下降,说明细胞DNA合成减少。加入沙棘总黄酮可提高G2/M和S期细胞数,说明沙棘总黄酮可促进DNA合成,对恢复促进细胞增殖有益,其作用机制还有待于进一步研究。本研究结果提示,沙棘总黄酮对受损血管内皮细胞有保护作用;为进一步研究沙棘总黄酮防治心脑血管动脉硬化相关疾病提供了理论基础。

[1]刘凤云.沙棘总黄酮的药理研究[J].中药材,2004,27(2)：145-146.

[2]Meng X,Li ZM,Zhou YJ,et al.Effect of the antioxidant alpha-lipoic acid on apoptosis in human umbilical vein endothelial cells induced by high glucose[J].Clin Exp Med,2008,8(1)：43.

[3]徐雅琴,张钧华,唐朝枢.氧化低密度脂蛋白和血管内皮损伤[J].心血管病学进展,2000,21(1)：26-29.

[4]王维蓉,林蓉,彭宁,等.丹参酮ⅡA对过氧化氢损伤人血管内皮细胞的保护作用[J].中药材,2006,29(1)：49-50.

[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J].Immunol Methods,1983,65(1-2)：55-63.