口腔常见厌氧性细菌感染检测基因芯片的研制

张 远,宋长芹＊,韩金祥,黄海南,李光武,于秀娟,汪晓静,宋立清

(1山东医学高等专科学校,济南 250002;2山东省医药生物技术研究中心; 3山东大学齐鲁医院)

厌氧性细菌是机体正常菌群的重要组成部分,但有少部分厌氧菌在一定条件下可致机体感染,通常用细菌培养方法和生化反应等实验来鉴定。但厌氧菌的培养需严格的厌氧环境,严重限制了临床标本厌氧菌的分离与鉴定。20世纪 90年代兴起的基因芯片技术,因其具有高度并行性、高通量、微型化和自动化的特点,在临床病原菌、毒力基因、抗药性基因等快速检测方面取得突破性进展。2009年 3月,我们采用细菌进化高度保守的16S rDNA为靶基因,在其保守区设计通用引物进行细菌基因扩增,在其特异区设计寡核苷酸探针并将探针点在基片上制成用于检测口腔厌氧菌感染的微阵列。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 标准菌株(购自四川大学华西口腔医院菌种保藏中心),分别是衣氏放线菌(Act,ATCC 12102),脆弱拟杆菌(Bac,ATCC 25285);具核梭杆菌(Fus,ATCC 25586),厌氧消化链球菌(Pep,ATCC 27337),牙龈卟啉单胞菌(Por,ATCC 33277)、产黑色素普雷沃菌(Pre,ATCC 13040)和小韦荣球菌(Vei,ATCC 10790)。仪器与试剂：PixSys 5500型点样仪,SMP3号点样针,CL-1000紫外交联仪,醛基化玻璃基片,Hybri Slips杂交盖片;Hybridization Cassette杂交盒;Scanarray 4000芯片扫描仪;凝胶成像系统(GS-363型ImagerTM2200)。PTC-200基因扩增仪;PAC300电泳仪。PCR基础试剂盒、上样缓冲液和DL-2000 Marker(TaKaRa公司);TIANamp Genomic DNA Kit。荧光标记引物(上海生工生物工程技术服务有限公司合成),其他引物及探针(上海博尚生物技术有限公司合成)。

1.2 方法

1.2.1 序列数据获取与处理 从美国国立生物技术信息中心(NCBI)下载所需的细菌16S rRNA基因序列数据,用Vector NTISuite 9.0对数据整理分析。

1.2.2 引物和探针设计 选择各种细菌的共有序列区作为通用引物设计的靶序列区,引物的设计和配置参照文献[1～4]并加以设计;选择各种细菌上下游引物之间的可变区作为特异性探针设计的靶序列区;选择与反义引物互补的核酸序列作为阳性质控探针;以大肠埃希菌(E.Coli)16S rRNA基因序列为阴性质控探针。

1.2.3 模板提取 按试剂盒说明书提供的步骤提取各标准菌株DNA。

1.2.4 PCR反应条件 16S rDNA、Act、Fus、Pre、Vei按照94℃3min,94℃30 s、55℃30 s、72℃60 s,共30个循环,72℃5min进行;Bac按照94℃3min,94℃30 s、48℃30 s、72℃60 s,共3个循环,72℃5min进行。Pep、Por按照94℃3min,94℃30 s、52℃30 s、72℃60 s,共 3个循环,72℃5 min进行。应用1.5%Agarose胶将扩增产物与Marker同时进行电泳分析,80 V电泳15～20 min,在ImagerTM2200上观察结果。

1.2.5 微阵列建立 用醛基化载玻片为基片,设立12个微阵列/基片,11种探针和一种点样液对照/微阵列;探针5′端有氨基基团、3′端有荧光(Tamra)基团;以3×SSC配成终浓度为20μmol/L的点样液,将样品点印到基片上。随机抽取一张芯片,观察其阵列制备情况及背景信号强度。微阵列制备后的芯片,经过水合、固化、浸泡、震摇冲洗、甩干处理,最后4℃避光保存。再次随机抽取一张处理后的芯片,观察其阵列制备及背景信号强度有无变化。根据所有探针和引物的Tm值计算其Tm平均值,Tm平均值以下 5℃为杂交温度中间值,在杂交温度中间值以下各 3℃分别设定一个实验值,进行杂交温度的实验;选择1、2、6、12 h进行杂交时间的实验;杂交体系选择3×SSC进行杂交体系的实验;根据前期工作基础建立杂交实验流程。

1.2.6 特异性检测 用6×SSC杂交液分别将标准菌株PCR产物对倍稀释、混匀、变性。向芯片的相应位置加入变性PCR产物,覆盖玻片、杂交2～6 h后取出芯片、去盖片、洗涤、离心甩干。将芯片放入扫描仪中,设定扫描参数为激光强度90%、PMT 90%进行扫描。

1.2.7 灵敏度检测 将各标准菌株PCR扩增产物等量混合,用6×SSC依次倍比稀释,使各管的PCR产物浓度依次为：1、2-1、4-1、8-1、16-1、32-1、64-1、128-1、256-1、512-1、1048-1、2096-1。杂交等步骤同1.2.6。

1.2.8 重现性检测 选择标准菌株Pep的PCR产物,用6×SSC对倍稀释、混匀后进行杂交试验。杂交等步骤同1.2.6。

1.2.9 稳定性检测 取两张芯片,一张芯片于点样后 4℃避光保存;另一张芯片于点样后 37℃避光保存。保存 30 d后在同条件下进行杂交试验。杂交等步骤同1.2.6。

2 结果

2.1 通用引物序列 正义引物序列(5'-actcctacgggaggcagcagt-3');反义引物序列(5'-cgtattaccgcggctgctg-3')。

2.2 探针序列合成 Act(5'-aagaaggtcctgctctttgtggtg-3');Bac1(5'-caagtagcgtgaaggatgaaggctc-3');Bac2(5'-agaataaagtgcagtatgtatactgttttgtatgtat-3');Fus(5'-taccaacagaagaagtgacggctaaa-3');Pep(5'-ttctgttgcaggggaagataatgac-3');Por(5'-gggaataacgggcgatacgagta-3');Pre(5'-gccaagtagcgtgcaggatgac-3');Vei(5'-agaaggattgacggtaccggaat-3');E.Coli(5'-gatgagaatgtgccttcgggaa-3');阳性探针序列(5'-cagcagccgcggtaatacg-3')。

2.3 制备并处理后的芯片质量 除了阳性荧光探针点具有荧光外,其他区域基本未检测到荧光,且阳性探针的荧光点排列规范、光强度均衡。

2.4 特异性检测 各标准菌株的PCR产物只与相应的探针结合(见图 1),特异性较高。

2.5 灵敏度检测 在 1∶1～1∶32的范围内,荧光强度几乎一致。在 1∶2096稀释浓度下,仍有阳性杂交结果,灵敏度较高。

2.6 重现性检测 12个微阵列的荧光强度几乎一致,重现性较高。

2.7 稳定性检测 在 4℃与 37℃分别保存 30 d后,微阵列的荧光强度基本一致,但4℃保存效果更好一些。

3 讨论

厌氧菌在体内主要分布于肠道、口腔、上呼吸道和女性生殖道等部位。不同种属的厌氧菌在体内分布不同,口腔中主要有牙龈卟啉单胞菌、产黑素普雷沃菌、具核梭杆菌、消化链球菌、韦荣球菌、不解糖卟啉单胞菌等。当机体抵抗力下降时,口腔中厌氧菌可通过龋洞侵入根管引起牙髓感染,或通过牙周袋侵入牙周组织引起牙周感染,或通过口腔破损引起口腔其他部位感染。临床常见的口腔感染有牙髓炎、根尖周炎、牙龈炎、牙周炎和口腔炎等,严重者可引起败血症。长期以来,临床检测细菌最常用的方法是细菌培养,一般而言,为鉴定出细菌的种类和了解该种细菌的药物敏感性,至少用时 3～4 d,且对于之前用过抗生素或生长缓慢的细菌,用时会更长,而对于厌氧菌培养、鉴定和药敏试验,还需要厌氧环境。因此,严重限制了临床厌氧菌的检测和相关研究工作的开展。

图1 特异性检测结果

20世纪末,建立在分子生物学和生物信息学基础上的生物芯片技术,以其高度并行性、高通量、微型化和自动化的突出特点,已在病原菌的基因分型、菌种鉴定及细菌抗药基因的检测方面进行了初步研究。芯片技术多以玻璃为基片、荧光标记探针,通过激光共聚焦显微镜或电荷偶联摄相机对荧光信号的强弱进行检测,计算机收集荧光信号并对每个点的荧光强度数字化后进行量化分析,能够在同一时间内分析大量的基因[5]。16S rRNA编码基因是指细菌染色体上编码rRNA相对应的DNA序列,存在于所有细菌的染色体基因组中,亦存在于衣原体、立克次体、支原体、螺旋体、放线菌等原核生物中,但不存在于非原核生物如病毒、真菌等体内。16S rRNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成,保守区为所有细菌所共有,可变区具有属或种的特异性,二者交错排列。因此,可根据保守区设计各种细菌的通用引物,根据可变区设计细菌的特异引物或探针。

目前建立的检测病原菌的基因芯片多用于需氧菌和兼性厌氧菌的检测,如Bavykin等[6]建立的微阵列技术,用于区分大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌等;Salama等[7]构建了H.pylori全基因组基因芯片,为难以分离的幽门螺杆菌鉴定提供了有效技术手段。

本研究利用DNA芯片的基本原理,选择临床上难于检测的厌氧性细菌为研究对象,制成DNA诊断芯片。在传统的Southern blot杂交技术基础上,通过对杂交体系和杂交条件的优化,筛选出一套对七种(多种)口腔厌氧菌同时检测的杂交体系和杂交条件,杂交结果通过荧光检测出来,经位置和荧光强度分析检测结果。该芯片设计的引物和探针合理,特异性、敏感性、重现性和稳定性方面符合实验要求,可用于口腔常见无芽胞厌氧性细菌感染的检测与诊断。

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[3]Martin FE,Nadkarni MA,Jacques NA,et al.Quantitative M icrobiological Study of Human Carious Dentine by Culture and Real-Time PCR：Association of Anaerobes with Histopathological Changes in Chronic Pulpitis[J].JClin Microbiol,2002,40(5)：1698-1704.

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