海南四种暗罗属植物挥发油对三种癌细胞的体外增殖抑制作用

张 园,王 菁,刘冰晶,袁 媛,陈光英＊,张信文

(1海南师范大学省部共建热带药用植物化学教育部重点实验室,海口 571158; 2海南师范大学生命科学学院)

暗罗属隶属于番荔枝科,全球暗罗属植物约有120余种,我国有 17种,其中海南 7种,分别为斜脉暗罗、细基丸、海南暗罗、香花暗罗、沙煲暗罗、陵水暗罗和暗罗[1]。在民间,暗罗属许多植物可供药用,海南岛黎族地区暗罗属植物长期用作治疗气滞腹痛、痛经、梅核气等疾病[1]。韩公羽等[2]发现陵水暗罗根中提取的暗罗素具有抗疟、抗霉菌的作用。吕子明等[3]发现陵水暗罗枝、叶中的巯基吡啶类化合物有较强的细胞毒活性。Verma等[4]发现印度暗罗属植物长叶暗罗叶的提取物及叶的氯仿部位能抑制人类各种癌细胞的增殖。我们前期研究发现海南暗罗属植物叶和茎氯仿、乙醇、乙酸乙酯提取物对人癌细胞具有一定抑制作用。为进一步研究其抗肿瘤作用的有效成分,2010年 8月,我们提取了斜脉暗罗、香花暗罗、海南暗罗和细基丸的茎和叶挥发油进行抗肿瘤活性研究,现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 高压灭菌锅(日本森展企业有限公司),倒置显微镜(重庆光学仪器厂);ELx800酶标仪(BioTek公司),CO2恒温培养箱(日本SANYO公司),超净工作台(苏州净化设备厂),可调式移液器(BRAND公司),96孔细胞培养板(Pore公司),电子天平(Sartious公司)。RPMI1640培养液、胰酶(Gibco公司),四甲基偶氮唑蓝(MTT,Sigma公司),超级新生牛血清(杭州四季青生物科技有限公司),二甲基亚砜(DMSO,天津市化学试剂二厂)。人肺腺癌细胞(SPCA-1)、人肝癌细胞(BEL-7402)和人白血病细胞(K562)由中科院上海生物所提供。细胞用含 10%胎牛血清、100μg/ml青霉素、100μg/ ml链霉素、0.2%NaHCO3的RPMI1640培养液,于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

1.2 植物来源与样品制备 斜脉暗罗、香花暗罗、海南暗罗和细基丸采自海南,由海南师范大学生命科学学院钟琼芯副教授鉴定,标本保藏于省部共建热带药用植物化学教育部重点实验室。分别取斜脉暗罗、香花暗罗、海南暗罗、细基丸的茎和叶各 25 g,用300ml乙醚 30℃索氏回流8 h,所得提取物为挥发油组分,即斜脉暗罗叶挥发油(PPL)、斜脉暗罗茎挥发油(PPS)、香花暗罗叶挥发油(PRL)、香花暗罗茎挥发油(PRS)、海南暗罗叶挥发油(PLL)、海南暗罗茎挥发油(PLS)、细基丸叶挥发油(PCL)、细基丸茎挥发油(PCS)八种挥发油,储存于4℃备用。

1.3 八种挥发油对三种癌细胞的抑制率(IR)及半抑制浓度(IC50值)测定 采用 MTT比色法[5,6]。SPCA-1、BEL-7402和K562分别以2×104、7×104、1 ×104个/ml接种于96孔板中,每孔体积180μl,在CO2培养箱内培养 8～12 h。同时设置空白组(仅加入不含细胞的培养液)和对照组(以培养液替代药物)。待细胞贴壁后,加入不同浓度(板内终质量浓度为1、10、100μg/ml)PPL、PPS、PRL、PRS、PLL、PLS、PCL、PCS各20μl。加药细胞培养44 h后,每孔加入MTT溶液(1mg/ml)50μl,继续在培养箱内孵育4 h,取出倾去上清液,每孔加入150μl的DMSO,振荡10 min,使用酶标仪于570 nm下测定各孔的光吸收值,实验重复3次。IR(%)=[OD(空白对照)-OD(药物作用)]/OD(空白对照)×100%。测定8种挥发油对三种细胞增殖抑制作用的 IC50值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件包进行One Way Anova统计分析。计量数据均以±s表示,行t检验,P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

8种挥发油对三种癌细胞均有一定抑制作用(P均＜0.05),且均呈一定剂量依赖性,在最大浓度为100μg/m l时的抑制率均接近 100%。8种挥发油对SPC-A-1、BEL-7402和K562的IR见图1、图2、图3,对三种细胞增殖抑制作用的 IC50值见图 4。

对SPCA-1抑制活性较好的PPL的IC50为4.01 μg/m l,PRL的IC50为3.39μg/ml,PRS的IC50为6.40μg/m l;对BEL7402抑制活性较好的PPL的IC50为2.70μg/ml,PCL的IC50为6.43μg/m l;对K562抑制活性较好的PPL的IC50为4.29μg/m l, PPS的IC50为4.90μg/m l,PLL的IC50为5.56μg/ m l。其中PPL对三种细胞的抑制作用均较好,优于其他七种。PPS对K562的抑制作用强于SPCA-1和BEL-7402。PCL对三种人癌细胞抑制活性亦均较好,IC50均＜15μg/ml。PLS和PCS对三种癌细胞均有一定抑制作用,IC50均＜25μg/ml,但与其余六种提取物比较无显著差异。

3 讨论

癌症是当今危害人类健康的主要疾病之一,目前化学药物抗肿瘤作用确切,疗效显著,但毒副作用大,长期应用易产生耐药性。我国有丰富的药用植物资源,而位于我国最南端的海南,由于特殊的地理位置和气候环境,资源尤其丰富,药用植物2500多种,占全国药用植物的 30%左右。因此从海南药用植物中寻找具有抗肿瘤活性的药物成为研究热点,将对中药抗癌药物的开发起到一定推动作用。

图1 8种挥发油对SPC-A-1的抑制活性

注：PPL为斜脉暗罗叶挥发油,PRL为香花暗罗叶挥发油PLL为海南暗罗叶挥发油,PCL为细基丸叶挥发油,PPS为斜脉暗罗茎挥发油,PRS为香花暗罗茎挥发油PLS为海南暗罗茎挥发油,PCS为细基丸茎挥发油

本研究首次对海南几种暗罗属植物中提取的挥发油抗肿瘤活性进行报道,暗罗属植物挥发油提取物的抗肿瘤活性总的来说较好,但种间存在一些差异。成分分析表明,这几种挥发油里面主要成分是倍半萜类。多项研究表明,倍半萜类化合物具有抗肿瘤活性。

于峰等[7]发现从菊科植物中分离出的三种倍半萜类化合物对人脑神经胶质瘤细胞、肝癌细胞、人黑色素瘤和人乳腺癌脑转移肿瘤细胞的生长具有抑制作用。王璐等[8]发现土木香中的 18种倍半萜对人肺癌细胞、人胃癌细胞、人急性早幼粒白血病细胞、人慢性髓性白血病细胞、人前列腺癌细胞、人乳腺癌细胞具有增殖抑制作用。

分析本研究资料,4种暗罗属植物挥发油均具有较好的抗肿瘤增殖活性,下一步我们将对活性较好的几个暗罗植物挥发油行进一步的活性成分分析,分离出单体化合物,进行体内体外的活性验证,确定其有效成分,并进行一些相关的抗癌机理研究,确定有效单体的具体抗癌机制,为抗肿瘤中药的开发提供基础数据和参考。

[1]中国科学院华南植物研究所.海南植物志[M].北京：科学出版社,1964：247.

[2]韩公羽,沈企华,姜渭,等.三种番荔枝科植物成分的生物活性研究[J].天然产物研究与开发,1998,11(3)：33-36.

[3]吕子明,戴胜军,陈若芸,等.陵水暗罗枝、叶中的巯基吡啶类化合物及其细胞毒活性研究[J].中国中药杂志,2010,35(1)：53-57.

[4]Verma M,Singh SK,Bhushan S,et al.In vitro cytotoxic potential of Polyalthia longifolia on human cancer cell lines and induction of apoptosis through mitochondrial-dependent pathway in HL-60 cells [J].Chemico Biological Interactions,2008,171(1)：45-56.

[5]Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival：application to proliferation and cytotoxicity assays[J].JImmunol Methods,1983,65(2)：55-63.

[6]吴舟锋.肿瘤化疗药物敏感性试验[J].国外医学：外科学分册, 1988,25(3)：153-155.

[7]于峰,王思明,董枚,等.三种倍半萜类化合物体外抗肿瘤细胞增殖活性研究[J].天然产物研究与开发,2010,22(3)：506-509.

[8]王璐,赵烽,何恩其,等.18种土木香倍半萜对 6种人源肿瘤细胞增殖的影响[J].天然产物研究与开发,2008,20(5)：808-812.