猪小肠黏膜下基质在组织重建中的研究进展

金娟，田伟

(1.沈阳医学院基础医学院2008级临床医学4班，辽宁 沈阳 110034;2.解剖学教研室)

小肠黏膜下基质 (small intestine submucosa，SIS)是一种不含细胞的天然细胞外基质材料。它有良好的细胞相容性，可促进多种细胞在材料上的黏附、生长和分化［1－2］。在超过1 000次的跨种交叉移植实验中，均表现为无免疫原性，而且直接免疫激惹实验无应答反应。体内降解速度也较快。与合成材料相比，所提供的环境和纤维结构更有利于细胞的生存、扩展及新陈代谢［3］。如将SIS植入宿主体内，可迅速诱导细胞浸润，刺激血管生成和宿主细胞生长分化，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似。研究表明SIS基本符合组织工程理想支架材料的条件，极有可能在组织体内完全再生。已用于包括血管在内的多种组织的重建［4－10］。本文就近年来诸多学者对SIS作为组织工程学中支架材料的研究报道加以综述。

1 SIS特性与优点

SIS由一层致密的结缔组织构成，其主要成份为Ⅰ和Ⅲ型胶原纤维，另含有少量Ⅴ和Ⅵ型胶原纤维，所含细胞较少。SIS含有多种生长因子，对组织的修复重建及细胞的生长有重要作用，其结构非常有利于细胞的黏附、增殖和分化，并且能刺激细胞分泌胶原等，因而具有良好的生物相容性和适当的机械特性，能承受周围组织压力，为再生细胞提供足够的生长空间，能迅速诱导细胞浸润、刺激血管生成和宿主细胞的长入和分化，逐渐完全降解，产生的再生组织在结构和功能上均与原有组织相似。

2 SIS制备

2.1 物理方法处理 取经过检疫的健康成年猪的空肠，运输过程中将小肠冰冻冷藏，在4h内完成清洁过程。用裹有纱布的刀柄去除小肠的浆膜层和肌层，其间持续用40℃水冲洗［11］。

2.2 化学方法处理 按Abraham方法［12］进行脱细胞和消毒、灭菌处理物理方法处理后的小肠。既没有细胞碎屑，又不损害小肠黏膜下层胶原的成分，降低免疫反应的程度，适合作修复材料［13］。

3 SIS在组织重建中的应用

3.1 体外构建组织工程骨膜的实验研究 取2月龄新西兰大白兔，自胫骨上段前内侧穿刺抽取骨髓4ml，制成骨髓间充质干细胞 (bone mesenchymal stem cell，BMSC)悬液，并传代培养。将传至第三代的细胞与SIS材料复合。相差显微镜观察:第7d后材料周围有较多细胞直接贴附于材料边缘。10d后大量细胞聚集材料边缘。细胞形态多为梭形及多角形。扫描电镜观察:复合培养5d，细胞散在材料表面，呈长梭形或不规则形，细胞间无连接。胞体表面有颗粒状物，可见微丝形成并附着在材料表面。培养7d以后细胞数量明显增多，细胞分泌旺盛，细胞间有大量胶原纤维丝，形成细胞间连接。部分细胞跨越孔隙，呈长梭形，有些正在分裂，有些重叠生长。培养10d以后细胞数量增多连成一片。2周时细胞数量更多，细胞层数也逐渐增加。细胞分裂增殖呈三维生长，细胞分泌大量细胞外基质，开始呈蜂窝状，缝隙逐渐被细胞外基质填塞而变得致密，细胞轮廓也变得模糊。SIS与BMSC复合培养4周，细胞通过细胞外基质紧密连接，结构连接致密。材料表面有多层细胞附着、增殖。McDevitt等［14］从 SIS中提取出转化生长因子-β，尽管在制备过程中经受过消毒、冻干等处理，仍具有生物活性，既可以促进BMSC分化、增殖，又能刺激成骨细胞和成软骨细胞增殖，增加Ⅰ型胶原、骨连接蛋白和骨桥蛋白合成。SIS与BMSC在体外复合培养可以构建出类似生物骨膜的组织工程骨膜，为进一步研究体内成骨奠定了基础［15］。

3.2 尿道结构和功能重建方面的实验研究 应用猪小肠黏膜下层进行兔尿道缺损修补。SIS具有良好的促再生特性，应用SIS修复的尿道缺损，可减少尿瘘和尿道狭窄的发生，术后4周可见上皮细胞再生，新生血管长入;术后12周其基本组织结构与正常尿道无明显差异，行逆行尿道造影显示，再生尿道的管腔与正常尿道无明显差异，表明SIS作为尿道修复重建的替代材料，不仅能实现组织学再生，而且可同时实现功能的重建［16］。

3.3 修复兔下颌骨缺损的实验研究 用猪SIS与纳米 β-磷酸三钙 (β-tricalcium phosphate，β-TCP)结合的复合支架材料，修复兔下颌骨缺损。复合支架组织骨密度较高，新生骨小梁形态较成熟。常跃文等［17］将SIS与β-TCP混合，修复大段骨缺损，结果显示这种复合骨支架材料表现出良好的成骨特性和组织相容性。猪SIS与纳米β-TCP复合支架材料，具有良好的成骨特性和组织相容性，能够有效地修复下颌骨缺损。

3.4 猪小肠黏膜下层替代兔跟腱的实验研究 用猪小肠黏膜下层制成SIS，用制成的SIS替代兔跟腱。SIS替代肌腱的过程是代谢过程，经过16周，SIS为宿主肌腱完全替代，其组织结构和力学性能与正常肌腱极其接近，实现了组织工程的最终目标，即完全再生。体内组织工程理论至少在肌腱再生方面是可行的［18］。

3.5 桥接周围神经缺损的实验研究 健康的SD大鼠，造成坐骨神经10mm缺损，用SIS桥接。于术后6周和10周取材，可见有再生神经组织长过缺损，呈条索状连续样，且神经纤维多集中在SIS形成的桥接管周缘区域，而中心区域可见胶原组织和孔隙较多。可见再生神经远端有毛细血管形成，未见大量淋巴细胞浸润，无明显的免疫排斥现象。SIS作为一种天然的细胞外基质，其促进周围神经轴突的具体作用机制尚不清楚。SIS中不仅含有大量的胶原组织，还含有透明质酸、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素A和硫酸皮肤素等氨基葡聚糖，由于多种细胞因子如神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-2，FGF-2)等需要特定的蛋白多糖来连接它们的受体从而发挥效应。故SIS有可能通过其含有的大量蛋白聚糖而利于细胞因子的黏附和发挥作用，从而进一步促进神经轴突的生长。另一方面，SIS中可提取的细胞因子主要包括FGF-2、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等。FGF-2不仅对多种体外培养的神经元具有神经营养作用，而且在周围神经损伤后的退变与再生中起着重要的作用。推测SIS通过其含有的多种氨基葡聚糖和细胞因子而起到促进神经轴突生长的作用。另外，SIS表面所具有的三维结构也利于神经轴突的生长。从本实验可见SIS具有促进周围神经轴突生长、修复周围神经缺损的作用。总之，SIS作为一种天然的生物材料，具有其特有的生物学特性，有望成为自体神经的替代材料而应用于周围神经缺损的修复［19］。

3.6 作为组织工程半月板支架材料 有人［13］通过SIS半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层复合培养。相差显微镜观察:72h后大部分细胞贴壁，细胞伸长，形成突起，呈梭形或多角形，随细胞数量增加，形态趋于一致，胞核大而圆、2～3个核仁，胞浆丰富，胞浆透明度好且分布均匀，内含分泌颗粒。第5d有较多细胞直接贴附于材料边缘，细胞形态和数量与单独培养细胞时的细胞形态和数量相同。第7d有大量细胞向材料边缘聚集，细胞形态多为梭形或多角形，连成一片。扫描电镜观察:复合培养5d时结果可见细胞间无连接，胞体表面有颗粒状物，可见微丝形成，附着在材料表面，随着时间的推移，细胞间开始有突起相连接，培养7d后细胞增多、分泌，细胞间通过突起相互连接，或伸出伪足帖附于支架孔隙壁上，部分细胞跨越孔隙，有的细胞重叠生长或正在分裂，细胞呈梭形或多角形。实验表明SIS作为组织工程半月板支架材料，有着巨大的应用潜力。

4 存在的问题

SIS用于腹壁的修复、膀胱的重建、硬脑膜的重建、跟腱的修补和回盲部的修补、小动物眼科临床上，并且取得了满意的疗效。但目前很多研究仍处于实验阶段，还有一些问题有待于解决，特别是组织工程用细胞支架材料植入体内后，材料的降解与细胞功能发挥是否同步，会不会产生遗传物质的改变、基因表达或基因突变等问题［20－21］。目前涉及神经修复的研究还不多，其中桥接周围神经缺损的实验，虽然从病理检查和电生理检查结果来看，SIS桥接神经组比自体神经移植组略差，但是我们可以通过进一步研究和探讨，包括构建有利于神经轴突生长的三维构型、引入各种促进神经轴突生长的细胞、细胞因子及构建利于神经轴突生长的微环境等，从而来改进SIS促进神经轴突生长的效果。除此之外，现有的生物材料在机体内易与周围组织粘连，在SIS制作过程中如何选用适合的生物涂层，防止其与周围组织粘连仍需要解决。随着各种相关基础研究的深入及临床应用的探索，SIS将在细胞相容性、可控制的降解率、力学强度上得到提高，在组织修复中发挥更大的作用［22－24］。

［1］罗静聪，杨志明，李秀群，等.小肠粘膜下层细胞相容性的研究 ［J］.生物医学工程学杂志，2004，21(5):800－804.

［2］ Poulose BK，Scholz S，Morre DE，et al.Physiologic properties of small intestine submucosa ［J］.JSurg Res，2005，123(2):262－267.

［3］ Santucci RA，Barber TD.Resorbable extracellularmatrix grafts in urologic reconstruction ［J］.Int Braz J Urol，2005，31(3):192－203.

［4］ Opitz F，Schenke-Layland K，Cohnert TU，et al.Tissue engineering of aortic tissue:dire consequence of suboptimal elastic fiber synthesis in vivo［J］.Cardiovasc Res，2004，63(4):719 －730.

［5］罗静聪，杨志明.小肠粘膜下层在组织修复中的应用 ［J］.国外医学:生物医学工程分册，2005，28(1):52－55.

［6］ Jernigan TW，Croce MA，CaqiannosC，et al.Small intestinal submucosa for vascular reconstruction in the presence of gastrointestinal contamination［J］.Ann Surg，2004，239(5):733－738.

［7］ Chung SY，Krivorov NP，Rausei V，et al.Bladder reconstitution with bonemarrow derived stem cells seeded on smell intestinal submucosa improvesmorphological and molecular composition ［J］.J Uro1，2005，174(1):353－359.

［8］ Smith RM，Wiedl C，Chubb P，et al.Role of small intestine submucosa(SIS)asa nerve conduit:preliminary report［J］.JInvest Surg，2004，17(6):339－344.

［9］ Derwin K，Androjna C，Spencer E，et al.Porcine small intestine submucosa as a flexor tendon graft ［J］.Clin Orthop Relat Res，2004，432:252－254.

［10］ Helton WS，Fisichella PM，Berger R，etal.Short-term outcomes with small intestinal submucosa for ventral abdominal hernia ［J］.Arch Surg，2005，140(6):549－560.

［11］张开刚，曾炳芳，张长青.小肠黏膜下层的制备及细胞相容性的实验研究 ［J］.中华创伤骨科杂志，2005，7(4):344－348.

［12］ Abraham GA，Murray J，Billiar K，et a1.Evaluation of the porcine intestinal collagen layer as a biomateria1［J］.JBiomed MaterRes，2000，51:442－452.

［13］王洪，赵玉鑫，杨述华，等.半月板纤维软骨细胞与小肠黏膜下层相容性的研究［J］.中华实验外科杂志，2007，24(9):1149.

［14］ McDevitt CA，Wildey GM，Cutrone RM.Transforming growth factorbeta in a sterilized tissuederived from the pig small intestine submucosa［J］.JBiomed Mater Res，2003，67:640－657.

［15］张开刚，曾炳芳，张长青，等.骨髓基质干细胞复合小肠黏膜下层体外构建组织工程骨膜的实验研究［J］.中华外科杂志，2005，43(24):1594－1597.

［16］朱英坚，卢慕峻，刘国华，等.应用猪小肠黏膜下层进行兔尿道缺损修补的研究［J］.临床儿科杂志，2009，27(2):172－175.

［17］常跃文，张长青，张晔，等.小肠黏膜下层/β-磷酸三钙复合骨支架材料修复大段骨缺损的能力［J］.中国临床康复，2005，9(14):27－29.

［18］顾延，戴尅戎.猪小肠粘膜下层替代兔跟腱的实验研究［J］.中华医学杂志，2002，82(18):1279－1282.

［19］苏琰，张长青，孙鲁源，等.小肠粘膜下层 (SIS)桥接周围神经缺损的实验研究［J］.中华创伤骨科杂志，2004，6(10):1136－1139.

［20］朴英杰.加强基础研究促进组织工程学协调发展［J］.中国临床解剖学杂志，2005，23(1):3－4.

［21］葛泉波，何淑兰，毛津淑，等.生物材料与细胞相互作用及表面修饰 ［J］.化学通报，2005，(1):43－48.

［22］李强，孙正义.软骨组织工程支架材料研究的现状［J］.中国组织工程研究与临床康复，2007，11(1):133－136.

［23］雷万军，李秉哲，曹谊林，等.组织工程骨和外科人工植入物的仿生技术研究［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(14):2721－2726.

［24］李兰英，刘晓丽，徐灵飞，等.壳聚糖液晶膜生物相容性的研究［J］.中国生物医学工程学报，2008，27(5):755－759.