RhoA在缓激肽选择性开放血肿瘤屏障中的作用

马 腾，刘啸白，薛一雪

(中国医科大学1.基础医学院神经生物学教研室、2.第96期临床医学7年制，辽宁沈阳 110001)

神经胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤，恶性脑肿瘤患者的术后化疗是目前治疗肿瘤的主要手段［1］。由于正常脑组织存在血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)，而肿瘤组织也存在着血肿瘤屏障(blood-tumor barrier，BTB)，从而限制了抗肿瘤药物进入肿瘤组织。因此有效地增加肿瘤组织中抗肿瘤药物的浓度，是提高化疗药物疗效的关键［2］。本实验前期研究发现缓激肽(bradykinin，BK)能够选择性开放BTB［3］，BK开放BTB过程中出现PKA下调，细胞骨架重排，神经型一氧化氮合酶升高，Akt磷酸化增加［4］等，但BK的作用是通过何种信号通路发挥作用以及分子机制如何，尚未见报道。

RhoA是近年来发现的一种重要的小G蛋白，参与许多血管活性物质介导的内皮细胞通透性升高的过程［5］。BK是通过与其2型受体(B2)作用开放BTB。B2受体属于G蛋白偶联性受体，BK、溶血磷脂酸和凝血酶都是G蛋白偶联受体激动剂，可以使COS-7和成纤维细胞的G蛋白偶联性受体激活，进而通过RhoA信号通路介导丝状肌动蛋白(filamentous actin，F-actin)细胞骨架重排，引起紧密连接相关蛋白occludin、claudin-5和ZO-1重分布，紧密连接(tight junction，TJ)开放［6］。上述信号转导通路是否参与BK开放BTB调节过程目前尚不清楚。

本研究的目的是明确BK与B2受体结合后是否通过RhoA介导调节细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白重分布，进而开放BTB。

1 材料与方法

1.1NU血清(BD Biosciences);FBS(杭州四季青公司);DMEM细胞培养液(Gibco公司);claudin-5抗体(Santa Cruz);phalloidin-TRITC荧光抗体，RhoA特异性抑制剂肉毒梭菌C3胞外酶(C3exoenzyme)，缓激肽，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)(Sigma)。

1.2脑微血管内皮细胞的培养和体外BTB模型的制作小于1周的胎大鼠用CO2吸入法处死，开颅取全脑，去除脑膜。分离培养大鼠脑微血管内皮细胞(Rat brain microvascular endothelail cell，RBMECs)的方法如文献［7］。对于所有的实验，只选用第一、二代细胞，细胞在37℃的湿润环境(5%CO2和95%的空气)中培养。按照Liu等［7］的方法建立体外BTB模型。

1.3实验分组与BK及抑制剂的处理由于本实验室前期工作已表明BK 15 min组，BTB的通透性达到峰值，以后逐渐恢复。所以本实验共分为5组(每组8例)，对照组(没有C6细胞共培养的RBMECs细胞单层)、BK 0 min组、BK 5 min组、BK 10 min组和BK 15 min组(BK处理的各组均采用的是体外BTB模型的细胞单层)。在对照组中加入等量的无菌生理盐水(1 μmol·L-1)处理15 min。(在预实验中，生理盐水处理 0、5、10、15 min 后，BTB 的通透性没有明显的差别，P＞0.05)。将RhoA特异性抑制剂C3exoenzyme(50 mg·L-1)加到Transwell小室的上室培养基中，作用4 h后移去上室的所有培养基，向上室加入 BK(1 μmol·L-1)。

1.4跨内皮阻抗值(TEER)的测量TEER是应用微孔电阻系统在37℃恒温下检测的，最终的TEER值与Transwell小室的表面积相乘计算，用Ω·cm2表示。

1.5辣根过氧化物酶(HRP)流量测定将Transwell中与C6细胞共培养的和单独培养的RBMECs细胞分别转移至一个新的24孔板中。将含有0.5 HRP μmol·L-1的无血清DMEM培养基加入Transwell小室的上室中。在经过BK作用后的特定时间点上，收集下室的培养基并通过色度法测量样品中的HRP含量。HRP流量用通过每平方厘米表面积的皮摩尔数表示。

1.6Western blot检测claudin-5的表达和分布当Transwell小室的上室的细胞生长到融合时，用含有0.1 mmol·L-1EDTA(不含有钙镁离子)的PBS冲洗，用细胞铲小心刮取下来，倒入1 ml裂解液 A(2 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1EGTA，0.1 mmol·L-1NaF，20 mmol·L-1Tris-HCl，protease inhibitor cocktail，PMSF，24 mmol·L-1Triton X-100 ，pH 7.5)，4℃匀浆，离心，收集上清(含可溶性片段)。在沉淀中加入150 μl裂解液B(裂解液 A加40 μmol·L-1SDS)，超声波匀浆，离心，收集上清(含不可溶性片段)。取40～50 μg总蛋白经12%SDS-PAGE电泳后转膜。抗Claudin-5抗体(1∶300;Santa Cruz)，抗 β-actin抗体(1∶800;Santa Cruz)4℃孵育过夜，在羊抗兔辣根过氧化物酶标记的IgG二抗(购自北京中山生物技术公司)中室温孵育1 h，ECL化学发光、X线曝光、显影，所得胶片用Chemi Imager 5500 V2.0软件扫描，通过 Fluor Chen 2.0软件进行定量分析，测得光密度值(integrated density value，IDV)。

1.7免疫荧光法和细胞荧光标记法观察claudin-5和F-actin表达和分布将生长在盖玻片上RBMECs单层用4%的多聚甲醛固定，12 mmol·L-1TritonX-100 透化，0.75 μmol·L-1BSA 封闭。采用间接免疫荧光法检测claudin-5，一抗为claudin-5抗体(1∶150;Santa Cruz)，阴性对照用0.01 mol·L-1PBS代替一抗，应用FITC标记的荧光二抗(1∶150)，避光条件下染色，甘油封片，荧光显微镜观察，采集图像。细胞骨架蛋白F-actin的检测采用细胞荧光标记法，细胞与phalloidin-TRITC(1∶200;Sigma)孵育2 h，荧光显微镜观察。

1.8统计学分析所有数据以±s表示，两组间采用t检验，多组间采用单因素方差分析和Bonferroni检验。

2 结果

Fig 2 Effect of C3exoenzyme on changes in HRP flux of BTB

2.1C3exoenzyme抑制BK介导BTB通透性的增加如Fig 1所示，BK作用5 min后TEER值开始降低，最低值出现在BK作用15 min时，BK 15 min组TEER值低于Control组和BK 0 min组，但BK 15 min+C3exoenzyme组TEER值较BK 15 min升高。如Fig 2所示，BK以时间依赖性方式增加HRP流量，BK 15 min组HRP流量高于Control组和BK 0 min组，但BK 15 min+C3exoenzyme组 HRP流量较BK 15 min组HRP流量值降低。

2.2C3exoenzyme抑制BK介导RBMECs跨膜蛋白claudin-5可溶性片段与不溶性片段比值增高如Fig 3所示，从BK作用5 min开始，claudin-5可溶性(S)片段和不溶性片段(IS)IDV比值升高，BK 15 min组claudin-5可溶性(S)片段和不溶性片段(IS)IDV比值高于 Control组和 BK 0 min组，C3exoenzyme预处理后，BK 15 min+C3exoenzyme组可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值较BK 15 min降低。

Fig 3 The IDV ratio of soluble fraction(S)and insoluble fraction(IS)of claudin-5 was detected by western blot

2.3C3exoenzyme抑制BK介导RBMECs紧密连接相关蛋白claudin-5的重分布及细胞骨架F-actin的重排免疫荧光分析显示，在未处理的细胞中，claudin-5位于内皮细胞膜上，且呈连续分布，claudin-5在细胞核中有表达(Fig 4a)。BK处理后，claudin-5由连续分布状态变为不连续分布，claudin-5在细胞膜表达水平的下降，由细胞膜向细胞质转移(Fig 4b)。C3exoenzyme预处理后，claudin-5部分恢复连续分布状态，claudin-5由细胞膜向细胞质转移明显减少(Fig 4c)。

BK作用前，F-actin呈环状连续地分布于RBMECs的边缘，未见应力纤维(Fig 4d)。BK作用后，分布于细胞边缘的F-actin减少，应力纤维形成增加，且分布在细胞中央区 (Fig 4e)。C3exoenzyme预处理后，分布于细胞边缘的F-actin明显增加，应力纤维形成明显减少(Fig 4f)。

Fig 4 Immunofluoresence localization of claudin-5 and F-actin in RBMECs of BTB after BK infusion

3 讨论

HRP是一种示踪剂，通过透过BTB的HRP流量可检测体外BTB通透性的变化;跨内皮细胞阻抗实验也是一种检测体外BTB通透性的实验。HRP流量实验和跨内皮细胞阻抗实验的结果显示，BK作用后TEER值明显降低，HRP流量明显增加，与Easton和Abbott报道的研究结果相一致［8］。本研究进一步发现应用RhoA特异性抑制剂C3exoenzyme预处理后，BTB的通透性升高，证明RhoA信号通路参与BK介导的BTB通透性增加的过程。

紧密连接(tight junction，TJ)是维持血脑屏障完整性重要的结构基础。claudin-5是构成紧密连接的主要跨膜蛋白，是维持紧密连接的结构和功能重要组成部分［9］。当claudin-5蛋白的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值升高时，说明紧密连接结构变化，通透性增加。本实验通过TritonX-100抽提技术结合Western blot分析同样证实了BK作用下claudin-5的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值明显升高，说明BK作用下，紧密连接结构发生了变化，进而导致通透性增加［10］。此结果与Nighot和Tenenbaum研究一致［11-12］。本研究还发现 C3exoenzyme预处理后，抑制了claudin-5的可溶性片段(S)与不溶性片段(IS)IDV比值升高，提示RhoA信号通路参与BK介导的TJ开放。

为了进一步明确RhoA信号通路与细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白重分布，BTB通透性增高的关系，细胞用C3exoenzyme预处理后，采用免疫荧光技术观察细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白重分布的变化，明确RhoA信号通路与细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白重分布的关系。研究发现BK作用后，claudin-5重分布，同时伴有大量应力纤维形成。可能应力纤维收缩，牵拉ZO-1蛋白，使细胞膜上跨膜蛋白claudin-5重分布，紧密连接结构变化，使BTB通透性升高。Birukova和Breslin的研究也表明［13］RhoA具有激发应力纤维形成，引起内皮细胞通透性增高的作用。C3exoenzyme抑制了claudin-5的重分布、F-actin的重排和应力纤维的形成。说明RhoA信号通路参与BK介导的细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白重分布，BTB通透性增高的过程。

上述结果证明，RhoA信号分子对BK介导的细胞骨架重排，紧密连接相关蛋白claudin-5重分布和表达水平的变化起到了重要的调节作用。

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