黄芪总皂苷提取方法的优化

高 山，郭爱华

(山西职工医学院，山西太原 030012)

黄芪是植物膜荚黄芪(Astragal us membranaceusB-ge)和蒙古黄芪(Astragal us membranaceusBge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的根[1]，为重要的补气药。而浑源黄芪 (hunyuanRadix Ast ragali)素有“天下黄芪之宗”的说法，其原植物以蒙古黄芪为主，主要含有皂苷类、黄酮类、多糖类以及氨基酸类等成分[2]。药理实验表明:黄芪总皂苷具有显著抑制血小板聚集和抗血栓形成的作用[3];黄芪皂苷可以促进淋巴增殖和抗体的增加，加强体液的细胞免疫应答[4];黄芪甲苷能够抑制组胺引起的脑微血管通透性增加[5]，可以清除氧自由基、抑制脂质过氧化、增强免疫力、抗病毒以及促进细胞增殖等[6]。本研究以黄芪甲苷为标准，采用比色法，对浑源黄芪中皂苷类化学成分提取工艺进行了探讨，为浑源黄芪等级的合理划分提供依据，从而为黄芪的种植、采收、加工、开发等提供科学数据和经验，以便于充分利用有限的药材资源和地质资源，提高黄芪基地的经济效益和社会效益。

1 材料与仪器

1.1 材料

浑源黄芪(由山西省浑源县黄芪基地提供)，山西医科大学天然药物教研室杨官娥教授鉴定为蒙古黄芪;黄芪甲苷标准品(由中国生物制品检定所提供，批号为110781-200613);所用水均为蒸馏水;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

756MC型紫外分光光度仪(上海分析仪器总厂);FA1104型万分之一电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造);202 V1型电热恒温干燥箱(上海试验仪器厂有限公司);KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);DZKW电热恒温水浴锅(北京市永光明医疗仪器厂);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);SHB-Ⅲ型循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)。

2 结果

2.1 含量测定方法学考察

2.1.1 线性关系考察

精密称取黄芪甲苷标准品5.500 mg，定容于10mL容量瓶中，分别吸取标准溶液0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.7mL(分别标记为 1、2、3、4、5、6)于具塞试管中，80℃ 水浴挥干，分别加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷却，加入5mL冰醋酸，于560 nm处比色，测吸光度A。以A为纵坐标y，溶质量为横坐标 x，绘制标准曲线，溶质量在0.110～0.385 mg范围内线性良好。回归方程为y=0.037 6+5.008 8x，r=0.999 7。线性关系见图 1。

图1 黄芪甲苷Fig 1 Astragaloside

2.1.2 精密度实验

精密量取对照品溶液0.5mL于具塞试管中，按线性关系考察项下自“80℃水浴挥干”起，至“加入5mL冰醋酸”操作，然后于560 nm处重复测定5次，测定吸光度平均值1.408，RSD为0.78%，结果表明仪器精密度良好。见表1。

表1 精密度测定结果Table 1 Precision

2.1.3 回收率实验

采用加样回收法，取已知总皂苷含量样品5份，精密称取各约3 g，分别精密加入黄芪甲苷对照品约1 mg，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液 ，精密量取0.1mL于具塞试管中，按线性关系考察项下自“80℃水浴挥干”起至“于560 nm处比色”操作，计算平均回收率为95%，RSD为1.28%。见表2。

表2 回收率实验结果 mg Table 2 Rate of Recovery

2.2 样品提取方法考察

称取黄芪粗粉3份，每份3 g，用15倍75%乙醇浸泡过夜(19:00时至次日10:00时)，超声40min，过滤。称取黄芪粗粉3份，每份6 g，用15倍75%乙醇浸泡过夜(19:00时至次日10:00时)，回流提取60min，过滤。

将上述所得滤液水浴蒸干，分别进行如下操作:蒸馏水转移，再用水饱和正丁醇萃取3次(10mL/次)，合并萃取液，用氨试液(40mL氨液加水至100mL)洗涤2次(10mL/次)，弃去氨水层，正丁醇层用蒸馏水洗涤2次(10mL/次)，弃去水层。正丁醇层60℃减压浓缩至干，甲醇转移至容量瓶中，分别定容至25mL(回流)或10mL(超声)。

取上述定容液(每种均取0.1mL、0.2mL)于具塞试管中，80℃水浴挥干，分别加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷却，加入5mL冰醋酸，于560 nm处比色，测A。计算数据见表3。

表3 超声与回流结果对比Table 3 Comparison of Results of Ultrasound and Reflux

从表3数据可看出，回流提取虽然时间较长，效果与超声提取效果并无明显差异。而超声相比之下具有操作简单、低温对成分破坏较小、提取时间短的优点，因此提取方法选择超声提取。

2.3 正交设计法优化超声提取

选择溶剂用量、提取时间、溶剂浓度三因素，分别取三水平，选用L9(33)因素水平表设计正交试验，各因素水平见表4。

精密称取9份黄芪样品各约3 g，按照正交表的9种组合条件进行提取(设计见表4)，滤液水浴蒸干，分别进行如下操作:用10mL蒸馏水转移，再用水饱和正丁醇萃取3次(10mL/次)，合并萃取液，用氨试液(40mL氨液加水至100mL)洗涤2次(10mL/次)，弃去氨水层，正丁醇层用蒸馏水洗涤2次(10mL/次)，弃去水层。正丁醇层60℃减压浓缩至干，甲醇转移至容量瓶中，分别定容至10mL。取定容液0.1mL于具塞试管中，80℃水浴挥干，分别加入0.2mL5%香草醛冰醋酸溶液和0.8mL高氯酸溶液，70℃水浴20min，流水冷却，加入5mL冰醋酸，于560 nm处比色，测A。计算各工艺皂苷类含量见表5，方差分析见表6。A为溶剂量(倍)，B为提取时间(min)，C为乙醇浓度(%)。

表4 正交试验因素水平表L9(33)Table 4 Level Chart of Factors of Orthogonal Test L9(33)

表5 回流法正交试验设计及数据统计Table 5 Test Design of Orthogonal Method foRReflux and Data Statistics

表6 黄芪总皂苷方差分析表Table 6 Analysis Chart foRAstragaloside Variance

2.4 结果

由表6的方差分析可知，各因素对实验结果的影响顺序为C＞A＞B，其中乙醇浓度对黄芪甲苷的提取有显著性的影响(P＜0.05)，乙醇用量的影响不显著(P＞0.05)，提取时间的影响不显著(P＞0.05)，综合考虑，既要保证皂苷类成分的提取，又要兼顾实际应用中的节能降耗，确定提取工艺条件可选方案 A2B3C1，即溶剂用量15倍，提取时间40min，乙醇浓度为70%，是最优提取工艺。

3 讨论

影响中药材提取的因素非常多，如提取方法、溶剂极性、溶剂浓度、溶剂用量、提取时间、药材粒度、浸泡时间等，本研究仅对提取方法、溶剂用量、提取时间、溶剂浓度四个因素进行分析，其余因素均采用同一水平。实验结果显示，当其他条件一致时，乙醇的浓度为70%，溶剂用量15倍，提取时间40min，既可以保证黄芪皂苷的提取，又可以有效地节约资源，为合理的提取工艺。

目前药典中黄芪皂苷的质量控制以黄芪甲苷为评价指标，因此，本文以黄芪甲苷为指标进行含量测定，优选提取工艺是合理的。本文采用比色法进行含量测定，具有易操作、简便、成本低、易推广的优点。

[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:化学工业出版社，2005.

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[3] 高 健，徐先祥，徐先俊，等.黄芪总皂苷抗血栓形成作用实验研究[J].中成药，2002，24(2):1161.

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