大鼠自发性乳腺癌生物学特性的研究*

陕西省中医药研究院实验动物中心(西安 710003)姚养正 姜姗姗 杨章民 齐 浩

乳腺肿瘤可发生于人类和大鼠的乳腺部位,肿瘤组织病理学形态各异,在肿瘤的同一体内也存在着明显不同的细胞亚群,表现在不同的细胞形态、核型、遗传标志物、生长率、细胞产物、受体、酶、免疫特性和对抗肿瘤药物的敏感性差异。肿瘤的生物学特性主要体现在增殖与分化的控制失调、浸润与转移性,但这不是所有肿瘤细胞的共同特性,只是在肿瘤组织中一部分细胞亚群具有浸润特性,并有不同的转移能力[1～5]。本文以我们自己建立的一株 CHN大鼠自发性乳腺癌为材料,对其在动物体内的生长与转移的生物学特性进行了研究,为揭示该瘤株在动物体内生长、浸润与转移规律奠定基础。

材料和方法

1 实验材料

1.1.动物:CHN、 SHR、WKY、 LOU/M近交系大鼠和 CHN×LOU/M F1代大鼠,由陕西省中医药研究院实验动物中心提供(合格证号为:医动字第 08-25号)。

1.2 瘤株:大鼠自发性乳腺癌瘤株,为本中心建立并保存。

2 实验方法

2.1 瘤细胞悬液的制备:取生长 20d的荷瘤大鼠用拉脱颈椎法处死,常规消毒,在无菌操作下取出肿瘤组织,剪去瘤周组织及坏死部分,用生理盐水冲冼,选择生长良好的新鲜组织,称取 2g置培养皿内,剪碎放入特制的 60目细胞筛里,按瘤重:生理盐水=1∶2(g/ml)的比例加入灭菌生理盐水,用研磨棒研磨或用组织研磨器研磨,根据实验需要调节细胞浓度。

2.2 瘤细胞数对大鼠自发性乳腺癌生长的影响:CHN大鼠 40只,雌性,体重 160± 10g随机分成四组,每组 10只。用同一瘤源制成的瘤细胞悬液,逐级稀释成不同浓度,每一浓度接种一组,每只大鼠右腋皮下接种瘤细胞悬液 0.2ml,注射的瘤细胞数分别为 2×109、2× 107、2× 105和 2× 103个。

2.3 不同接种途径对大鼠自发性乳腺癌生长的影响:CHN大鼠 40只,雌性,体重 160± 10克,随机分成四组,每组 10只。用同一瘤源制成的瘤细胞悬液,分别在每组大鼠右腋皮下、腹腔、后肢肌肉和尾静脉各接种瘤细胞悬液 0.2ml,注射的瘤细胞数均为 2×106个。

2.4 大鼠性别对自发性乳腺癌生长的影响:CHN大鼠 20只,雌雄各半,体重 160± 10g,按性别分成二组,每组 10只。用同一瘤源制成的瘤细胞悬液,分别接种于每组大鼠右腋皮下 0.2ml,注射的瘤细胞数均为 2× 106个。

2.5 不同品系大鼠对自发性乳腺癌生长的影响:CHN、SHR、WKY、LOU/M 和 CHN×LOU/M F1大鼠共 50只,按大鼠品系分成五组,每组 10只。各组大鼠均为雌性,体重分别为 CHN大鼠 160±10g,SHR大鼠 130±10g、WKY大鼠 130± 10g、 LOU/M大鼠 130±10g,CHN× LOU/M F1 160±10g。用同一瘤源制成的瘤细胞悬液分别接种于每组大鼠右腋皮下 0.2ml,注射的瘤细胞数均为 2×106个。

2.6 大鼠自发性乳腺癌浸润与转移的观察:分别对不同接种途径形成的肿瘤进行观察,待荷瘤大鼠接近死亡前,取肿瘤、浸润与转移肿瘤,用 10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋切片,HE染色,在光镜下做病理学观察。

3 统计学处理 采用 SPSS13.0软件处理。

结 果

1 不同瘤细胞数对肿瘤生长的比较 动物成瘤观察结果见表 1,可以看出,各组大鼠移植不同数量的瘤细胞悬液后,肿瘤发生率均为 100%,其肿瘤潜伏期和宿主存活时间随接种瘤细胞数的减少而延长,趋势明显。如果从宿主存活时间中减去潜伏期的天数,自瘤结可触知至死亡,比较各组大鼠存活天数、肿瘤重量和瘤系数均无显著性差异(P＞0.05)。

表1 瘤细胞数对大鼠自发性乳腺癌生长的影响(±s)

表1 瘤细胞数对大鼠自发性乳腺癌生长的影响(±s)

注:组间两两相比*P＞ 0.05,△P＞ 0.05,#P＞ 0.05

瘤细胞数(个)接种鼠数(只)长瘤鼠数(只)成瘤率(%)潜伏天数 荷瘤宿主存活天数宿主瘤重(g)瘤系数2× 109 10 10 100 3.3± 0.46 55.3± 8.22* 42.5± 430△ 0.32± 0.02#2× 107 10 10 100 5.4± 0.52 58.7± 8.88* 40.7± 5.79△ 0.29± 0.02#2× 105 10 10 100 7.3± 0.48 60.9± 7.75* 40.3± 2.98△ 0.30± 0.01#2× 103 10 10 100 9.9± 0.88 67.2± 7.24* 40.8± 42△ 90.28± 0.02#

2 不同接种途径对肿瘤生长的比较 成瘤观察结果见表 2,分析发现各组大鼠接种瘤细胞后,肿瘤发生率均为 100%。皮下与肌肉内接种瘤细胞,局部均可长出较大的瘤块;腹腔内接种瘤细胞悬液后,可见在腹腔内形成大小不等的实体性肿瘤结节,但是未见腹水形成;静脉接种瘤细胞悬液后,在胸腔、肝与胸膜内形成多个实体性瘤结节。虽然不同接种途径的成瘤率均为 100%,但带瘤宿主的平均存活时间有非常显著的差异(P＜0.001),其中腹腔接种后存活时间最短,肌肉接种最长。

表2 接种途径对大鼠自发性乳腺癌生长与存活时间的比较

3 大鼠性别对肿瘤生长的比较 动物观察结果见表 3,肿瘤在不同性别大鼠中移植成活率均为100%,比较荷瘤大鼠宿主存活时间、瘤重和瘤系数在雌雄大鼠之间均无显著性差异(P＞0.05),提示大鼠自发性乳腺癌属于非激素依赖性瘤株。

4 大鼠不同品系对肿瘤生长的观察 动物观察结果见表 4,可以看出大鼠自发性乳腺癌仅在 CHN系大鼠和 CHN× LOU/M F1代大鼠体内呈进行性生长,肿瘤发生率为 100%,而且动物体重与瘤重成正比。统计结果表明,CHN大鼠与 SHN×LOU/M F1代大鼠体重与瘤重差异性非常显著(P＜0.01);但是比较 CHN大鼠与 SHN×LOU/M F1代荷瘤大鼠的存活天数与瘤系数却无显著性差异(P＞0.05);肿瘤在SHN、WKY和 LOU/M品系大鼠体内则不能生长,显示大鼠自发性乳腺癌是 CHN近交系大鼠的一种同基因型(Syngeneic)瘤株。

表3 大鼠性别对大鼠自发性乳腺癌生长的影响(±s)

表3 大鼠性别对大鼠自发性乳腺癌生长的影响(±s)

注:雌雄相比*P＞0.05

性别 瘤细胞数(个)接种鼠数(只)长瘤鼠数(只)成瘤率(%)荷瘤宿主存活天数 宿主瘤重(g)瘤系数雌 2× 106 10 10 100 42.8± 6.27 42.1± 4.18 0.31± 0.04*雄 2× 106 10 10 100 43.2± 5.99 41.1± 3.35 0.03± 0.03*

表4 大鼠自发性乳腺癌在不同大鼠品系中的生长情况(±s)

表4 大鼠自发性乳腺癌在不同大鼠品系中的生长情况(±s)

注:CHN与 SHN× LOU/M F1相比*P ＜0.01,**P＞ 0.05

大鼠品系 瘤细胞数(个)接种鼠数(只)长瘤鼠数(只)荷瘤宿主存活天数(x-±SD)宿主瘤重(g)瘤系数CHN 2× 106 10 10 47.7± 10.8 44.2± 6.72* 0.28± 0.05**SHR 2×106 10 0 0 0 0 YKY 2×106 10 0 0 0 0 LOU/M 2×106 10 0 0 0 0 CHN× LOU/M F1 2× 106 10 10 45.0± 8.83 38.4± 4.03* 0.35± 0.02**

5 肿瘤浸润与转移的病理学观察 大鼠腋部皮下接种瘤细胞悬液后,见皮下肿瘤生长、瘤细胞排列成条索状,可见残留毛囊。引起汇流淋巴结和肺部的转移灶,前者癌细胞排列成腺管状和条索状,后者破坏原有肺组织,侵至支气管周围,癌细胞呈立方状并且排列成小梁状。

大鼠肌肉接种瘤细胞后,形成的局部肿瘤,癌细胞呈立方状或扁平状,形成大小不等的腺腔样结构;在心、肺、肝、脾和直肠均可见到转移灶。在心腔内形成实体性肿瘤,心壁肌肉遭受破坏,癌细胞为多边形,大小不等,排列成巢状。肺部可见大小不等的转移癌结节突起,破坏原有肺组织,癌细胞呈多边形、异形性明显,排列成片状。肝转移灶癌细胞呈多边形或扁平形,前者排列成小粱状,后者则围成大小不等的腺腔。脾转移灶癌细胞呈多边形,形成巢状,融合成片,而胃肌层转移癌细胞排列成条索状,形成少数腺腔,直肠肌层转移癌细胞则为多角形,并形成不规则的腺管样结构。

大鼠腹腔接种瘤细胞悬液后,在腹腔内形成大小不等的实体性瘤结节,癌细胞呈多边形,有的则为扁平状,排列成不规则的腺管,间质丰富。肿瘤侵犯肝、脾、胃及肠道,受侵犯的肝、脾组织与癌组织分界不清,癌细胞排列成巢状及条索状,同时见肿瘤侵至胃、小肠、结肠和直肠外膜及肌层,癌细胞多数排列成巢状或小粱状,肾包膜则可见癌细胞排列成小巢状或条索状。

大鼠静脉接种瘤细胞后,在胸腔内形成多个实体性瘤结节,癌细胞显示典型的上皮特征,为多边形,有的胞浆透亮,排列成巢,可见腺样结构。在心、肺、肝和肾脏可见转移灶。心腔内形成实体性肿瘤紧附于心室壁,附着部心内膜被破坏,瘤体附着部可见小梁状血栓形成,癌细胞大小不等,呈多边形,排列成片状;肺组织表面可见多发性肿瘤结节隆起,破坏原有肺组织,癌细胞成片状,残留肺组织呈代偿性肺气肿;正常肺组织被癌组织代替,两者分界不清,癌细胞为多边形,排列成不规则条索状;肾皮质形成的肿瘤,破坏原有的肾组织,两者分界不清,癌细胞为多边形或立方状,排列成条索状,可见腺管形成。

讨 论

不同瘤细胞数对大鼠自发性乳腺癌生长的比较,其潜伏期和宿主存活时间成明显负相关,与以往有关小鼠乳腺癌瘤株的报告相吻合[6]。在本实验中,接种瘤细胞数最大为 2×109个,此时肿瘤潜伏天数为 3.3±0.46d,宿主存活时间为 55.3±8.22d,但当瘤细胞数减少到 2×103个时,潜伏天数见增加 2倍,宿主存活天数延长了 22%,仍表现出大鼠自发性乳腺癌细胞对CHN大鼠的高度适应性。尽管接种不同瘤细胞数量的潜伏天数和宿主存活天数的差异有非常显著性(P＜0.001);但是其瘤体重量和瘤系数之间均无显著性差异(P＞0.05)。因而可以认为在本实验条件下,大鼠自发性乳腺癌细胞接种 CHN大鼠后,导致动物死亡的移植瘤体积是一个相对稳定的值,肿瘤重量约为 40.3±2.98g。

不同途径(皮下、肌肉、腹腔和静脉)接种大鼠自发性乳腺癌细胞后,肿瘤发生率均为 100%,提示本瘤株无论以何种途径接种于 CHN大鼠体内,均可造成CHN大鼠移植性肿瘤,但是不同接种途径的宿主存活天数明显不同,以腹腔接种者大鼠存活天数最短(29.3±2.45d),以肌肉接种者存活天数最长(62.4±3.2d)。这种情况符合人类恶性肿瘤转移的规律,实际上由于腹腔的条件适合肿瘤生长,而且具有相当的肿瘤种植面积,因此恶性肿瘤腹腔播散者临床预后差,存活时间短[7]。

不同性别大鼠接种大鼠自发性乳腺癌移植成活率为 100%,带瘤大鼠宿主存活时间、肿瘤重量和瘤系数在雌雄大鼠之间均无显著差异(P＞0.05),同小鼠乳腺癌 MC-615瘤株相似。提示大鼠自发性乳腺癌是非激素依赖性瘤株。

大鼠不同品系接种瘤细胞悬液后,肿瘤仅在 CHN系大鼠与 CHN× LOU/M F1代大鼠体内生长,而在CHR、WKY和 LOU/M系大鼠体内不生长,证明大鼠自发性乳腺癌是 CHN大鼠的一种同基因型瘤株,同小鼠 MC-615瘤株相似。

此外,不同接种途径均程度不同地发生脏器转移,其中以肌肉和静脉内接种最为严重,转移灶累及心、肝、脾、肺、肾和消化道。腹腔内接种主要引起腹腔内有关脏器外源性转移浸润;而腋部皮下接种肿瘤形成局部移植瘤外仅造成汇流淋巴结与肺脏的移癌;肌肉部位血管丰富,移植肿瘤后易发生全身性血道转移;静脉接种更是如此。事实上各器官组织转移性肿瘤的发生率也不同,形态表现各异,好发情形不同,各自具有不同的临床意义。根据临床统计,肝和肺是血道转移最易侵犯的器官,分别占脏器转移的 40%～50%和 30%～40%。肝脏血液供应十分丰富,肝组织很可能为瘤细胞提供合适的生长环境,肺脏是机体进行气体交换的场所,肺组织也可能为肿瘤细胞生长提供所需的氧气与二氧化碳。大鼠自发性乳腺癌在 CHN大鼠中接种易发生肝、肺转移,提示肝、肺脏器官同人类一样为瘤细胞生长提供合适的条件。人肾脏转移癌占 7.6%,而且以乳腺肿瘤来源的转移癌最为多见,转移灶绝大多数位于肾皮质部,尤其在肾包膜下,本文所见大鼠自发性乳腺癌肾转移也具有这个特点。

人类乳腺癌可通过淋巴或血行转移,也可直接扩散到邻近的组织。经淋巴扩散最常见的是转移到同侧腋窝淋巴结,也可扩散到乳淋巴结或其他区域淋巴结。尽管乳腺癌可转移至任何部位,但最常见的部位是骨、肺及肝脏[1]。大鼠自发性乳腺癌的转移也具有淋巴道和血道转移的特点,而且在心脏观察到转移癌属罕见,脾脏及消化道转移也属少见,这可能与脏器的功能结构有关。但是大鼠自发性乳腺癌在 CHN大鼠体内造成的转移癌累及部位之多,这与瘤株本身的恶性程度有关,也与宿主 CHN大鼠的易感染性有关。因此,我们可以认为 CHN大鼠自发性乳腺癌瘤株是一个独特的,容易复制的乳腺癌动物模型,这将为研究乳腺癌转移机制及治疗提供一种新的瘤株。

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