IL-17R在韦格纳肉芽肿患者外周血免疫细胞的表达

姜 波,王 红,刘布骏

(南京大学医学院附属南京鼓楼医院风湿免疫科,江苏南京,210008)

韦格纳肉芽肿(WG)为一种累及全身多个器官包括上/下呼吸道和肾脏系统的坏死性肉芽肿血管炎,尽管在我国发病率不高,但严重影响患者的生活质量及生存率。目前,WG的病理机制尚不明确。近年来研究发现,新的T细胞亚群-IL-17产生细胞(Th17)在很多自身免疫病中有重要的参与作用。Th17不同于Th1和Th2,产生标志性的细胞因子IL-17,与细胞的表面受体-IL-17RA/RC结合,诱导中性粒细胞的募集及淋巴细胞的浸润和活化而参与免疫反应。已发现IL-17在类风湿关节炎[1]、多发性硬化[2]、系统性红斑狼疮[3]、大动脉炎[4]和炎性肠病[5]患者中的表达显著升高。Abdulahad等研究表明,与正常人相比,WG患者外周血Th17(IL-4、IL-17、IFN-γ)比例显著升高,WG的自身抗原-胰蛋白酶3(PR3)刺激后,ANCA阳性患者外周血Th17的比例显著升高,提示IL-17参与WG的病理损害,且与ANCA的产生相关[6],但具体机制不明。考虑到WG的血管炎损伤主要由循环中大量的自身抗体PR3-ANCA介导,后者由B细胞分化的浆细胞产生。在其他自身免疫病如系统性红斑狼疮中,已证实IL-17与自身抗体-抗双链DNA(dsDNA)抗体[7]和抗组蛋白抗体[8]的产生相关。因此WG患者体内Th17产生的IL-17可能通过与其下游B细胞表面IL-17受体-IL-17R结合后诱导后者产生自身抗体-ANCA而发挥病理作用。至今IL-17R在WG患者体内特别是淋巴细胞上的表达尚无相关研究。本实验将通过检测IL-17R在WG患者外周血免疫细胞包括中性粒细胞(PMN)、单核细胞(Mono)、总淋巴细胞(Lym),特别是B淋巴细胞和浆细胞上的表达有无异常,探索WG的病理机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象

20例符合1990年美国风湿病学会(ACR)分类标准的WG患者,6例为非活动期患者,伯明翰血管炎活动性评分BVAS3[9]=0分。14例活动期患者,BVAS3均大于 0分,其中环磷酰胺(Cyc)治疗组6例,甲氨喋呤(MTX)治疗组8例。20例性别和年龄相匹配的正常人(HC)作为对照。

1.2 试剂

流式细胞仪所用荧光标记的小鼠抗人单抗如下:APC标记的抗IL-17R和同型对照IgG1,FITC标记的抗CD38、FITC标记的抗 CD20和同型对照IgG1,PE标记的抗CD19同型对照IgG1,以及红细胞裂解液,均购自BD Pharmigen公司。

1.3 流式细胞仪检测IL-17R表达

取5 mL EDTA抗凝的静脉血,1 200转/min室温离心10 min,PBS洗涤3次。细胞沉淀以100 μ L PBS重悬,分别加入流式抗体APC-抗IL-17R+PE-抗FITC-抗CD38,APC-抗 IL-17R+PE-抗FITC-抗 CD20,同型对照APC-IgG1+PE-IgG1+FITCIgG1,4℃避光孵育30 min。1.5 mL红细胞裂解液在4℃避光孵育10 min,1 200转/min 4℃离心10 min,弃上清,细胞重悬于500 μ L流式缓冲液中。FACS Calibur(BD Bioscience)流式细胞仪检测,CellQuest软件分析数据。

2 结 果

2.1 比较IL-17R在WG患者和正常人外周血免疫细胞上的表达

流式细胞仪检测了IL-17R在WG患者(n=20)和正常人(n=20)外周血PMN、单核细胞、总淋巴细胞、B淋巴细胞浆细胞上的表达。结果发现,IL-17R在WG患者和正常人PMN、单核细胞、总淋巴细胞上的表达无显著差异,但在WG患者B淋巴细胞(P<0.05)和浆细胞(P<0.05)上的表达显著高于正常人。

2.2 比较IL-17R在活动期与非活动期WG患者外周血免疫细胞上的表达

根据BVAS3评分将WG患者分为活动期(n=14,BVAS3>0分)与非活动期(n=6,BVAS3=0分),流式细胞仪比较了IL-17R在2组患者外周血免疫细胞包括B淋巴细胞以及浆细胞上的表达。结果发现,活动期与非活动期WG患者中性粒细胞、单核细胞和总淋巴细胞表面 IL-17R的表达无差异,与非活动期患者相比,活动期患者IL-17R在B淋巴细胞及浆细胞上的表达有下降趋势,但在统计学上无显著差异。

2.3 比较IL-17R在CyC与MTX治疗组WG患者外周血免疫细胞上的表达

流式细胞仪比较了IL-17R在Cyc(n=6)和MTX(n=8)治疗组患者外周血中性粒细胞、单核细胞、总淋巴细胞、B淋巴细胞及浆细胞上的表达。结果发现,对于各种免疫细胞包括不同发育阶段B细胞,IL-17R的表达在2个治疗组间均无显著性差异,见表1。

表1 IL-17R在各治疗组WG患者外周血免疫细胞上的阳性率(%)

3 讨 论

IL-17的生理功能主要是作为促炎因子发挥作用,例如刺激IL-6、一氧化氮和前列腺素E2(PGE2)的产生[10],还可协同其他炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF)-α和IFN-γ[11]等加剧及放大局部炎症反应,以及介导中性粒细胞和单核细胞趋化至炎症部位[12]。研究发现IL-17参与很多自身免疫病[1-5],其作用机制不明,可能与其诱导自身抗体产生相关[7-8]。David等研究发现,在肾小球肾炎模型鼠-BXD2中,IL-17可直接作用于生发中心的B细胞,促进其发育、迁移及分化为抗体产生细胞[13]。IL-17在韦格纳肉芽肿病理机制中的参与作用尚属初步探索阶段。如前所述,WG患者体内外周血中Th17及IL-17增多,自身抗体ANCA阳性的患者Th17升高更为明显[6],故推测IL-17可能诱导浆细胞产生ANCA。因此,有必要检测WG患者体内不同发育阶段的B淋巴细胞特别是浆细胞表面IL-17受体-IL-17R的表达是否存在异常。

作者实验发现,IL-17R在WG患者外周血B淋巴细胞及浆细胞表面的表达显著高于正常人,提示与正常人相比,IL-17对WG患者B细胞发育的初始阶段及分化为抗体产生细胞终末阶段的作用均显著增强,这与WG患者体内增多的Th17比例及 IL-17浓度一致,即Th17通过产生IL-17与B细胞表面IL-17R相互作用,进一步启动下游信号如抗体产生等参与WG发病。有趣的是,活动期WG患者B淋巴细胞及浆细胞表面IL-17R的表达并不高于非活动期患者,甚至有下降趋势,原因尚不明确,可能的机制为活动期患者为控制病情,采用较强的免疫抑制剂联合治疗,甚至使用药物的冲击剂量,而缓解期患者多采用一种缓和的免疫抑制剂维持,免疫抑制剂的药理作用可能抑制了B淋巴细胞表面 IL-17R的表达,这尚需进一步实验确定。

因IL-17还可诱导中性粒细胞和单核细胞趋化至炎症反应部位,作者还比较了IL-17R在WG患者和正常人群的这2种细胞表面的表达。结果发现,无论是WG患者和正常人之间,还是活动期与非活动期WG患者间,IL-17R在中性粒细胞和单核细胞的表达均无显著差异,提示IL-17可能通过其他途径参与WG的炎症进展。

为探索不同治疗药物对IL-17R的影响,作者还检测了WG常用的免疫抑制剂-环磷酰胺和甲氨蝶呤治疗组外周血中性粒细胞、单核细胞和B淋巴细胞、浆细胞上IL-17R的表达。结果显示,两个治疗组间无明显差异,提示在这两种免疫抑制剂的疗效差异中,IL-17R的表达并非决定因素。

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