Aspergillus niger C15产柚苷酶发酵条件的优化研究

李志坚，谭兴和，李高阳

（1.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙 410125；

2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128）

Aspergillus niger C15产柚苷酶发酵条件的优化研究

李志坚1，谭兴和2，李高阳1

（1.湖南省农产品加工研究所，湖南长沙 410125；

2.湖南农业大学食品科技学院，湖南长沙 410128）

通过正交实验对黑曲霉菌株C15产柚苷酶的发酵条件进行了优化。实验结果表明，Aspergillus niger C15菌株的最优产酶发酵条件为：2%桔皮粉、6%豆粕粉，250mL三角瓶中装料30mL，接种量3%，最适初始pH为5.0，30℃条件下培养100h，产酶量可达1395.9U/mL。与原始产酶条件相比，产酶量提高8.6%。不同的金属离子对产酶有不同的作用，添加适量的K2HPO4、MgSO4对产酶有明显的促进作用，CuSO4、FeSO4对产酶起抑制作用。

柚苷酶，黑曲霉，条件优化

就柑桔汁而言，产品出现的过度苦味是柑桔加工业所面临的严重问题[1-3]。柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶组成的一组复合酶系[4]，能水解柑桔中的主要苦味物质柚皮苷成为无苦味的柚配质、鼠李糖和葡萄糖[5]。最初柚苷酶是Hall[6]从芹菜种子中分离得到的，它能在一定条件下将柚皮苷分解而苦味消失。后来Ting S V[7]在一些利用真菌发酵生产的果胶酶制剂中也发现并分离出这种酶，同时还发现用这种酶处理柚子汁可导致其总黄酮的含量会明显减少。胡奎等[8]从堆积腐烂柑桔的土壤中分离得到产柚苷酶的曲霉SN-90系，郭倩等[9]通过在腐烂的柚子皮上收集的天然菌株经过分离初筛获得产柚苷酶菌株。赖崇德等[10]则以桔皮粉作为唯一的碳源和氮源，从腐烂的桔皮上分离出一株产柚苷酶菌株A166，酶活力可达到955.6U/m L。由于酶法脱苦具有专一、高效、快速、对果汁风味和营养成分无影响等特点，已成为目前最理想的脱苦方法[7，11-12]。但目前应用酶法脱苦还存在着高产菌株缺乏、产酶效率低、成本高等问题。国内还没有工业化生产的商品柚苷酶制剂，只有日本等少数发达国家有工业化生产，而且价格昂贵，在生产实践中使用进口柚苷酶将会使企业生产成本大大增加。以上原因导致柚苷酶在柑桔深加工中的应用受到了极大的限制，因此筛选柚苷酶高产菌株、生产高品质的柚苷酶商品酶制剂已成为当务之急。本文以从自然界筛选得到的一株产柚苷酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger C15为出发点，较为系统地研究了接种量、发酵温度、碳氮源、培养基初始pH、发酵时间等因素对菌株产柚苷酶的影响，通过正交实验对C15菌株产柚苷酶的发酵培养基组成及发酵工艺条件进行了优化，旨在获得柚苷酶发酵的最佳条件，为进一步工业化生产柚苷酶提供理论和技术依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

黑曲霉Aspergillus niger C15 本实验室分离筛选获得，酶活1285.6U/m L；柚皮苷（99.8%）、鼠李糖（99%） 郑州荔诺生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2、CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、NH4H2PO4、MnSO4·4H2O

国药集团化学试剂有限公司，分析纯；蛋白胨、酵母膏 上海市宝典化工有限公司；豆粕粉、麸皮、米糠、淀粉 市售；桔皮粉 自制，过80目筛，柚皮苷含量经HPLC检测约为6.3%。

全温振荡培养箱 太仓市华美生化仪器厂；高速冷冻离心机 美国贝克曼库尔特公司；LC-20A液相色谱仪 SHIMADZU株式会社岛津制作所；精密pH计 梅特勒-托利多公司。

1.2 实验方法

1.2.1 摇瓶发酵培养基制备 豆渣（含水40%）10%，豆粕4%，葡萄糖2%，柚皮苷0.02%，自然pH，加水至1000m L，250m L三角瓶装液量30m L，0.1MPa蒸汽灭菌20m in。

1.2.2 发酵培养 将菌种斜面孢子活化后制成1×106个/m L孢子悬液，然后接种到摇瓶发酵培养基，置于振荡培养箱（30±1）℃培养3d。

1.2.3 粗酶液的制备 取摇瓶培养物1m L，以3000r/m in离心20m in，所得的上清液即为粗酶液。

1.2.4 柚苷酶酶活测定方法 取2m L 0.1%柚皮苷标准溶液和0.2mol/L、pH 4.0醋酸缓冲液1.9m L置于试管中，在40℃恒温水浴中预热4～5m in，然后加入粗酶液0.1m L，充分摇匀，准确保温30m in后，加热至100℃使酶失活，离心取上清液，经0.45μm滤膜过滤，用液相色谱仪测定柚皮苷含量。柚苷酶活力的定义为：在温度为40℃、pH 4.0条件下，每分钟每毫升酶液分解柚皮苷的微克数[5]。

1.2.5 不同接种量对产酶的影响 分别以1%、3%、5%、7%、9%、11%的接种量接种到摇瓶培养基中，以恒温30℃、180r/m in的转速条件下摇床培养。每个接种量进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.6 不同发酵温度对产酶的影响 以上述实验具有最高酶活的接种量接种到摇瓶培养基中，分别以20、25、30、35、40℃等不同的发酵温度条件下，以恒温30℃、180r/min的转速摇床培养。每个发酵温度做三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.7 不同碳源对产酶的影响 选择葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麸皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖11种不同碳源以2%的添加量添加到摇瓶培养基中，以30℃、180r/m in摇瓶培养，每种碳源进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.8 不同氮源对产酶的影响 分别以豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）28种不同含氮物质作为氮源分别以4%的添加量添加到摇瓶培养基中以30℃、180r/min的条件摇瓶培养，每种氮源进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.9 添加无机盐的种类对产酶的影响 分别以0.1%的添加量添加CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO4到摇瓶培养基中充分溶解后于30℃、180r/min摇瓶培养，并以未加入上述无机盐发酵液的酶活作为对照。每种无机盐进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.10 培养基初始pH对产酶的影响 在摇瓶培养基组成和其他条件不变的情况下分别调节培养基pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0在30℃、180r/m in条件下摇瓶培养，每个pH进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。

1.2.11 装液量对产酶的影响 分别将20、30、40、50、60m L不同量的液体培养基分别加入到250m L三角瓶中，在30℃、180r/m in条件下进行摇瓶培养，每个装液量进行三次平行实验，72h后测酶活，取平均值。1.2.12 发酵时间的选择 以1.2.5具有最高酶活的接种量接种到摇瓶培养基中，在温度30℃、180r/min、自然pH条件下摇床培养。每隔12h测发酵液酶活及水溶性蛋白含量。

1.2.13 产酶条件的优化 选择桔皮粉用量、豆粕粉用量、发酵温度、发酵时间作为因素进行L9（34）正交实验设计，因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

2 结果与分析

2.1 不同接种量对产酶的影响

不同接种量对产酶的影响见图1。实验结果表明，当接种量较低时，酶活性较低，可能是由于所形成菌丝体密度不够，不利于酶的生成；但当接种量增加到5%时，酶活性也较低，则可能是由于培养基中营养物质不能充分满足菌体生长，导致形成的菌丝体较细小，同时散热比较慢，所产生的废气也不易排出，不利于酶的形成。从图1中可看出，当接种量为3%时，发酵液中的酶活达到最高，与其他接种量差异极显著，由此可确定，3%即为最合适的接种量。

图1 不同接种量对产酶的影响Fig.1 Effect of starter amounton naringinase productivity

2.2 不同发酵温度对产酶的影响

在发酵系统中保持稳定而合适的温度环境是保证酶活性的重要条件。本实验研究了在20、25、30、35、40℃等不同的发酵温度对产酶的影响，结果见图2。

图2 不同发酵温度对产酶的影响Fig.2 Effect of temperature on naringinase productivity

由图2可知，在温度范围20～30℃时，随着温度的升高，产酶活性迅速上升，当温度到达30℃时，酶活达到最大值1156.4U/m L，与其他各个温度差异较显著，温度偏高或偏低都不利于产酶。温度升高，反应速率加大，生长代谢快，生产期提前，但菌体容易衰老，发酵周期缩短，从而影响酶的最终产量。其次，温度过高还可能导致柚苷酶性质不稳定甚至失活。温度过低，繁殖周期加长，菌体总量较低，直接影响酶的产量。由此可确定，菌株的最适产酶温度为30℃。

2.3 不同碳源对产酶的影响

选择11种不同碳源：葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麸皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖，添加到摇瓶培养基中，用量均为2%，进行摇瓶发酵，测发酵液中柚苷酶的活力。不同碳源对菌株产柚苷酶的影响结果见图3。

图3 不同碳源对菌株产柚苷酶的影响Fig.3 Effectof different carbon sources on naringinase productivity

从图3可以看出，以桔皮粉和蔗糖+柚皮苷作为碳源最有利于产酶，葡萄糖+柚皮苷、鼠李糖次之，且与其他碳源差异极显著。可能是由于葡萄糖效应的存在，以葡萄糖+柚皮苷作为碳源时的酶活较蔗糖+柚皮苷低。以麸皮、米糠、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖等作为单一碳源时，发酵液中柚苷酶的酶活很低，这说明柚苷酶在液态发酵条件下须在诱导物如柚皮苷的诱导下才能产生。实验同时发现柚皮苷的水解产物鼠李糖对柚苷酶的形成也有一定的诱导作用，但柚皮苷的诱导作用更好，此实验结果与张晨等[13]的研究结果吻合。由此可见柚苷酶底物的诱导作用较产物的诱导作用更强。由于柚皮苷价格较昂贵，而桔皮粉是一种廉价易得复杂的有机物质成分，除含有起关键诱导作用的柚皮苷外还含有丰富的糖类及少量有利于微生物生长的粗蛋白和矿质元素，作为碳源不仅可以大大减少酶的生产成本，而且产柚苷酶与以蔗糖+柚皮苷作为碳源相当，故选择桔皮粉作为菌株产柚苷酶的最佳碳源。

2.4 不同氮源对产酶的影响

研究表明，发酵过程中应对氮源的种类和浓度进行严格控制，尽量避免不适当的氮源及浓度对菌体生长和酶的形成产生负面影响。选择8种不同氮源（豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2）分别添加4%到摇瓶培养基中进行摇瓶发酵，测发酵液中柚苷酶的活力，结果见图4。

图4 不同氮源对菌株产酶的影响Fig.4 Effectof various nitrogen sources on naringinase productivity

由图4可以看出，在几种不同的氮源中，以豆粕粉作为氮源时酶活最高，其次为硝酸铵和硫酸铵。其中豆粕粉是一种廉价易得的氮源，除含丰富的蛋白质和氨基酸外，还含有一些适合微生物生长繁殖的碳水化合物如低聚糖和大量维生素如维生素E等，另外还含有一些对产酶有明显促进作用的矿质元素如Mg2+等，因此，选择豆粕粉作为菌株发酵培养基的氮源。

2.5 添加无机盐的种类对产酶的影响

选择CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO49种无机盐分别以0.1%的添加量添加到摇瓶培养基中进行实验，测定发酵液酶活，并以未加入上述无机盐的发酵液的酶活作对照。结果见表2。

实验结果表明，在所选择的几种无机盐中，K2HPO4、MgSO4·7H2O两种无机盐则对产酶具有明显的促进作用，可能是由于K+和Mg2+作为多种酶的激活剂，在酶与底物结合时起桥梁作用从而促进了酶的产生；ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O对产酶有明显的抑制作用，可能是由于Zn2+、Fe2+等金属离子与酶结合后改变了酶的空间构象，抑制了酶的活性，也可能是由于培养基中这几种金属离子浓度已能充分满足菌体生长和产酶，额外添加则导致浓度过高从而抑制的酶的产生；CaCl2、NaNO3、NaCl和MnSO4·4H2O对产酶的影响不明显。

表2 无机盐种类对产酶的影响Table 2 Effectof inorganic salton the naringinase production

2.6 不同发酵液初始pH对产酶的影响

微生物在生长过程中会不断地消耗碳源和氮源，同时也会造成培养基pH发生变化。而酶的产生需要一个合适的pH范围。霉菌有着极强的繁殖能力[14]，对生长和产酶的pH范围较宽，一般在3.0～8.5之间变动。在摇瓶培养基组成和其他条件不变的情况下用柠檬酸或氨水调节培养基到不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）进行摇瓶发酵，测定发酵液中柚苷酶的活力，不同初始pH对产酶的影响结果见图5。

图5 不同初始pH对产酶的影响Fig.5 Effectof initial pH on naringinase productivity

大多数菌种有维持其体内细胞酸碱度在近中性条件的能力，有利于菌体进行正常的新陈代谢。但发酵液的pH将会对菌株的产酶反应有间接的影响。由图5可以看出，在pH 3.0～5.0时，随着pH的上升，酶活迅速增加；在pH 4.5～5.5范围内，酶活保持在较高水平，达1000U/m L以上，并在pH为5.0时达到最高峰，为1167.4U/m L，与其他pH差异较为显著。由pH6.0～8.0，酶活呈下降趋势。由此可见，pH偏高或偏低都不利于菌体产酶，因此确定发酵培养基起始pH为5.0。

2.7 装液量对产酶的影响

分别将20、30、40、50、60m L不同量的液体培养基分别加入到250m L三角瓶中，进行摇瓶培养，测发酵液中柚苷酶的活力。培养基占摇瓶体积比对产酶的影响见图6。

图6 不同装液量对产酶的影响Fig.6 Effectof differentmedium contained in flask on naringinase productivity

由图6可知，250m L三角瓶中装液量为30m L时，柚苷酶酶活最高，为1146.3U/m L。由此可见，该菌株产柚苷酶对培养基中氧含量要求较高，随着装液量的上升，酶活开始下降，这可能是由于装液量过多导致摇瓶内的剩余空间变小，培养基中的溶氧量相应减少，抑制了菌丝体的生长和酶的形成。当装液量小于30m L时，酶活较高，但在实际操作中若装液量过少，如小于20m L时，不便于粗酶液的提取而且导致效率降低，生产成本增加。综合考虑以上因素，本实验选取最适装液量为250m L三角瓶装液量30m L。

2.8 发酵时间的选择

将所筛选菌株进行摇瓶发酵，并在发酵过程中不同时间取样，测定发酵液中的柚苷酶的活力和水溶性蛋白质含量，发酵液的变化情况见图7。

图7 发酵时间对产酶的影响Fig.7 Effectof fermentation time on naringinase productivity

由图7可知，菌株在培养基中发酵产酶，柚苷酶活性的高峰出现时间为连续培养100h前后，酶活达1123.2U/m L，此时水溶性蛋白含量也达到了最高，为0.41mg/g，说明菌体也获得了最大限度的生长。本实验以取得最大产量的柚苷酶为目标，因此发酵周期定为100h，可得到最佳产柚苷酶活力。

2.9 产酶条件的优化

采用L9（34）正交实验对菌株产酶条件进行优化，实验结果见表3。对表3进行直观分析发现，组合2即A1B2C2D2柚苷酶活力最高。从极差值R看出：各因素影响柚苷酶活力主次顺序为发酵温度＞豆粕粉用量＞发酵时间＞桔皮粉用量。综合分析发现，A1B3C2D2为最优培养基组成，即桔皮粉2%、豆粕粉6%、发酵温度为30℃、发酵时间为100h菌株产柚苷酶能力最佳。利用DPS统计软件对实验结果进行方差分析，结果见表4。由表4可知，各个因素的显著性顺序依次为：C＞B＞D＞ A，因素B、C、D均达到了显著水平（p＜0.05），A因素的作用不显著。由于A1B3C2D2组合不在实验之列，故需要再进一步作验证实验。

表3 正交试验表L9（34）Table 3 L9（34）orthogonal test

表4 正交试验方差分析结果Table 4 Resultof orthogonal experiment variance analysis

2.10 验证实验

按正交实验得到的最优组合A1B3C2D2，即桔皮粉2%、豆粕粉6%，发酵温度为30℃、发酵时间为100h（培养基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，接种量为3%，发酵液初始pH为5.0，250m L三角瓶中装液量为30m L）进行验证实验，平行做三份，实验结果分别为1397.2、1408.5、1382.1U/m L，三个平行实验的柚苷酶活力平均值1395.9U/m L较表3中酶活力值最高的组合2即A1B2C2D2有小幅度提高，说明该最优组合工艺合理可行。

3 结论

采用单因素实验和正交实验设计相结合的实验方法，对柚苷酶产生菌的产酶条件进行了优化，得到了Aspergillus niger C15菌株的最优产酶发酵条件，其组成为：2%桔皮粉、6%豆粕粉，培养基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，250m L三角瓶中装料30m L，接种量3%，最适初始pH为5.0，30℃条件下培养100h，产酶量可达到1395.9U/m L。与优化前产酶条件相比，产酶量提高8.6%。通过实验充分证明了不同的金属离子对产酶具有不同的作用，适量添加K2HPO4、MgSO4·7H2O对产酶有促进作用，而ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O则对产酶起抑制作用，生产过程中应尽量避免使用含有此类对产酶产生抑制作用离子的容器。

[1]励建荣，梁新乐，王向阳，等.柑橘类果汁脱苦技术[J].食品与发酵工业，1999，26（1）：55-58.

[2]张晨，刘志伟.柑橘类果汁的脱苦[J].江苏食品与发酵，2000（1）：26-28.

[3]孙兰萍.柑橘类果汁苦味物质的脱除研究[J].食品工业科技，2003，24（1）：97-100.

[4]IMagario，A Neumann，EOliveros，etal．Deactivation kinetics and response surface analysisof the stability ofα-L-rhamnosidase from penicillium decumbens[J]．Appl Biochem Biotechnol，2009，152：29-41．

[5]汪钊，毛富根．柚苷酶产生菌的选育及发酵条件研究[J]．微生物学报，1995，22（1）：18-22．

[6]Hall，Donald H.A new enzyme of the glycosidase type[J]. Nature，1938，3586（142）：150.

[7]王志国.微生物与柑桔汁脱苦[J].食品科学，2000（11）：10-14.

[8]胡奎，李帮秀，吴珍龄.柚苷酶产生菌的选育[J].西南农业大学学报，2003，25（2）：141-143.

[9]郭倩，邬应龙，黄高凌，等.柚苷酶产生真菌的复筛及菌种初步鉴定[J].食品科学，2008，29（2）：225-228.

[10]赖崇德，蔡华静，夏海林，等.一株产柚苷酶菌株黑曲霉的分离及菌种鉴定的初步研究[J].江西农业大学学报，2005，27（5）：759-763.

[11]汪钊，毛富根.柚苷酶固体发酵及消除桔子汁苦味的研究[J].食品科学，1996，17（6）：17-19.

[12]郑育仁.柑橘类果汁脱苦技术的研究[J].漳州职业大学学报，2003（2）：110-112.

[13]张晨，刘志伟，郑彦彤，等.产柚苷酶菌株B04的分离及产酶特性研究[J].工业微生物，2007，37（5）：38-41.

[14]霉菌[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/36020.htm.

Study on the optimum fermentation conditions of
Aspergillus niger C-15 for the production of naringinase

LIZhi-jian1，TAN Xing-he2，LIGao-yang1
（1.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China；
2.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

The fermentation cond itions for Aspergillus niger C15 naringinase p roduc tion were op timalized by orthogonal experiment.The experimental result ind icated that the best fermentation conditions was as follows：2%citrus peelmealand 6%soybean meal，30m L culture media in 250m L beaker flask，3%inoculation amount，initial pH 5，incubation tem perature 30℃，time 100h.Under these op tim ized cond itions，the yielding capacity of naringinase by the mutant was 1395.9U/m L，which was increased by 8.6%com pared w ith the initial level（1285.6U/m L）.Proper quantity of K2HPO4and MgSO4could imp rove naringinase p roduction，CuSO4，FeSO4were bad for p roducing enzyme.

naringinase；Aspergillus niger；op tim ization

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0229-05

2012－01－05

李志坚（1977-），男，硕士，助理研究员，研究方向：农产品加工及贮藏。

国家863计划项目（2007AA10Z307）。