邻苯二甲酸单苄酯单克隆抗体的制备

李 乐，任洪林，李岩松，周 玉，冯晓丽，刘艳艳，唐 峰，李兆辉，王光明，卢士英，柳增善

（吉林大学 人 兽共患病研究所教育部重点实验室 畜 牧兽医学院，吉林 长 春130062）

邻苯二甲酸酯类（PAEs）属于环境激素类物质，以增塑剂、软化剂、载体等应用在化妆品、洗涤用品、建筑材料和润滑油中［1］。人体可通过呼吸，饮食，皮肤接触等方式摄入PAEs，进入人体内被代谢成相应的单酯，且有毒性单酯的及生物活性超过双酯［2］。尿液中邻苯二甲酸单苄酯（mono－benzyl phthalate，MBzP）与精子的活力和精子的浓度有关，可影响生殖系统的相关激素的水平，对胎儿及男性生殖系统有一定的影响［3，4］。研究发现 MBzP对SD大鼠具有胚胎毒性，可引起胚胎生长缓慢，同时对胚胎有致畸作用。目前，对MBzP的检测方法主要是反相高效液相色谱分析法（HPLC），此方法费高，时长，无法用于现场检测。而免疫法有速度快、费用低、仪器易携、灵敏度高和选择性强等优点。本研究通过制备邻苯二甲酸单苄酯的单克隆抗体为免疫学检测奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 Balb／c小鼠，雌性，8－10周龄，购于长春生物制品研究所；SP2／0－Ag14小鼠骨髓瘤细胞，为本实验室保种传代。

1.2 主要试剂 MBzP购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、邻苯二胺（OPD）、HAT、HT、50%PEG1000等购自美国Sigma公司；四季清胎牛血清为长春宝泰克生物制品有限公司产品；PRMI－1640培养基购自GIBCO公司；辣根过氧化物标记羊抗鼠IgG购自中杉金桥。

1.3 主要仪器 倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（上海力新公司）；96孔可拆卸酶标板、酶联免疫检测仪（NUNC公司）。

1.4 方法

1.4.1 MBzP完全抗原的制备 利用 MBzP分子中的羧基在N，N－二环己基碳二亚胺的作用下与N－羟基琥珀酰亚胺反应生成活泼酯衍生物，后者与载体蛋白的氨基反应，形成以酰胺键连接的偶联物，具体制备方法参照文献［5，6］。完全抗原用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行鉴定。

1.4.2 小鼠的免疫 MBzP－BSA与等量的弗氏完全佐剂混合乳化，皮下多点注射免疫，100μl／只，免疫三只；每隔15 d免疫一次，三免后第7 d，小鼠断尾采血，用ELISA法检测血清效价，具体步骤参见文献［7］。

1.4.3 单抗的制备 血清效价达到细胞融合要求后，进行细胞融合。采用有限稀释法将阳性杂交瘤细胞克隆化，直到克隆细胞阳性率达到100%时再进行扩大培养。采用体内诱生法制备腹水，利用辛酸－硫酸铵方法纯化腹水［8］。然后对纯化的腹水进行SDS－PAGE鉴定，检测纯化后腹水的抗体纯度。1.4.4 单抗的亚类及亲和力的鉴定 利用小鼠单抗亚类鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的亚类类型。按照试剂盒说明书操作。利用间接ELISA方法对抗体的亲和力进行测定［9］。

2 结果

2.1 MBzP完全抗原的鉴定

偶联产物因连接上小分子使其电荷数量改变，迁移速率变快，证明完全抗原制备成功。鉴定结果见图1。

图1 MBzP完全抗原的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果

2.2 单抗的筛选与鉴定 小鼠第三次免疫7 d后，检测小鼠血清效价，按P／N≥2.1为阳性，效价可达到1∶25600，符合细胞融合的要求。选择血清效价最高的小鼠进行细胞融合。利用间接ELISA筛选出阳性杂交瘤细胞1B9，经过三次克隆后阳性率达到100%，进行扩大培养注入小鼠体内，制备腹水。利用辛酸－硫酸铵法纯化腹水，纯化后的腹水进行SDS－PAGE电泳，可见清晰两条带，一条为重链，另一条为轻链，杂带明显减少，得到了相对较纯的单克隆抗体。结果如图2所示。采用间接ELISA法检测纯化后的腹水，结果显示单克隆抗体1B9的腹水效价可达1：1.28×105。经过亚类试剂盒鉴定此株单抗亚类为Ig M。抗体的亲和常数为2.32×108。

图2 腹水纯化SDS－PAGE图

3 讨论

MBzP是小分子物质，属于半抗原，只有反应原性，不具有免疫原性，不能刺激机体产生免疫应答，需要与大分子载体蛋白偶联后才能达到免疫效果。半抗原与载体蛋白连接时，需要根据半抗原的特性选择合适的方法，MBzP具有羧基，可以采用活泼酯法，羰二亚胺法和混合酸酐法进行偶联。选择偶联方式时应考虑半抗原的溶解度、稳定性、结合键的位置以及适合的偶联试剂等因素［10，11］。这三种方法都会存在一定的副反应，本实验采用活泼酯法进行偶联是因为活泼酯法是对碳二亚胺法的改进，可避免蛋白质分子间的交联［12］。合成后的人工抗原经过非变性凝胶电泳证实了完全抗原的偶联成功，可进行下一步实验。

细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤，本实验采用聚乙二醇法进行细胞融合。（1）PEG分子量对细胞融合的影响：PEG的分子量越大粘性越大，毒性也越大，如加入PEG时出现细胞凝聚现象可能与其分子量有一定的关系，即分子量越大出现凝聚块也越大。融合可选用的PEG的分子量在1000－6000均能达到一定的融合效果，但不同分子量的PEG所对应的作用时间也不相同，分子量大的相对作用时间应减少。目前，大多数选用分子量1000的PEG进行细胞融合，融合率稳定且毒性相对小些。（2）PEG的作用时间对细胞融合的影响：PEG具有一定的毒性，作用时间过长会对细胞造成一定的损伤，作用时间过短会使细胞融合不充分。经试验摸索作用时间为40－120 s内可得到较好的融合效果。（3）PEG的p H对细胞融合的影响：一般PEG的p H在6.8－7.4之间即可，但也有报道显示在偏碱条件下，p H＝8.0时的融合效果比较好［13］。（4）温度对PEG的融合的影响：PEG在37－40℃的条件下有助于提高融合率，可能是因为温度对细胞膜的流动性有一定的影响，随着温度的升高膜的流动性及通透性都会有所加强［14］。控制好细胞融合的条件是提高细胞融合率的前提保障，在细胞融合24 h后可粗略看下细胞是否有污染，HAT是否有效的抑制了骨髓瘤细胞的生长，因为HAT存放时间过长可能导致其失效，如果发现细胞孔内细胞的数量有明显增多的现象说明HAT失效，此时应及时补加有效的HAT，如无任何异常情况，尽量不去观察或移动细胞。在融合的第6 d进行换液，因为此时细胞处于生长缓慢的潜伏期，比较脆弱，过早换液或经常移动不利于细胞的稳定生长。在随后的细胞培养中也可能会出现细胞生长缓慢，逐渐皱缩，死亡的状态，所以，在细胞的生长期应密切注意观察细胞的状态，如发现异常，应及时对所用试剂包括培养基的血清含量、培养基的酸碱度、双抗的浓度及细胞培养箱中CO2的含量、温度和水分是否充足等进行排查，及时找出原因挽救细胞［15］。

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