响应面法优化花生纳豆的发酵工艺

齐凤元 李欢欢 杨 利 王国洋 马 勇

响应面法优化花生纳豆的发酵工艺

齐凤元 李欢欢 杨 利 王国洋 马 勇

(渤海大学化学化工与食品安全学院，锦州 121013)

以黄豆和花生为原料，制作花生纳豆，研究花生纳豆的最佳制作工艺条件。通过Plackett－Burman试验筛选了影响花生纳豆发酵的3个重要因素，即黄豆与花生的质量比、接种量、发酵时间;利用最陡爬坡试验和Box－Behnken试验，以感官评价和氨基酸态氮为指标，确定最佳发酵条件。结果表明最佳发酵条件为黄豆与花生的质量比为4∶1，121℃蒸煮30 min，接种量3%，40℃发酵18 h。花生纳豆的感官品质和风味都要优于传统纳豆。

花生纳豆 发酵 感官评价 氨基酸态氮

纳豆是日本的传统发酵食品，由纳豆芽孢杆菌发酵蒸煮的黄豆而成，纳豆除含黄豆的全部营养外，还含有纳豆激酶、超氧化物歧化酶及维生素B12和维生素K2等，使纳豆具有独特的食疗作用。纳豆富有黏性，其黏性物质主要为多糖和γ－多聚谷氨酸［1］。近年来，纳豆作为一种功能性食品，逐渐被人们重视。但是传统纳豆均以黄豆为单一原料，口感及风味很难被大多数中国人接受［2］。为了解决这一问题，有从改善菌种以及添加辅料等方面着手，也有从调整原料配比来加以改善［3－6］。而以花生和黄豆为原料，制作花生纳豆，鲜见有对其进行研究。花生含有丰富的碳水化合物、蛋白质和脂肪，花生中的白藜芦醇、单不饱和脂肪酸和β谷甾醇等物质能抑制血小板非正常凝聚、预防心肌梗塞和脑栓塞等心脑血管疾病［7］，花生一直是功能性食品的重要原料。本试验以黄豆和花生为原料，制作一种纳豆新产品——花生纳豆，探讨花生纳豆的最佳发酵条件。

1 材料与方法

1．1 材料与设备

黄豆、花生:均为锦州当地产;纳豆芽孢杆菌:中国工业微生物菌种保藏管理中心。LDZX－40SC型立式自控电热压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂;303－6A数显电热保温箱:上海阳光实验仪器有限公司;JB－90－2型定时磁力搅拌器:上海衡平仪器仪表厂;BCM－1000A型生物洁净工作台:深华生物技术有限公司;L－8800型氨基酸自动分析仪:日立公司。

培养基采用肉汤培养基:牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL，加热溶解后用纱布过滤，用4%NaOH调pH至7．0～7．4［8］;斜面固体培养基:营养琼脂。

培养基均121℃灭菌15 min。

1．2 方法

1．2．1 菌种的活化、保存和扩大培养

将纳豆菌菌粉接入肉汤培养基中，40℃培养16～24 h，传4代至性状稳定;接种至斜面固体培养基保存备用;从斜面挑取1～2环纳豆菌于肉汤培养基中，40℃扩大培养16～24 h，即为纳豆芽孢杆菌发酵液。

1．2．2 工艺流程

1．2．3 操作要点

前处理:选取颗粒饱满、大小均一、无霉烂和虫蛀的花生和黄豆，清洗后，与水按质量比1∶3分别浸泡14～20 h，水温为17～20℃，使花生质量为浸泡前的1．6倍，黄豆质量为浸泡前的2．2倍，沥干水分。

混合:将泡好的花生剥去红衣后，将花生与黄豆按质量比1∶4混匀，装入发酵罐，每罐50 g，用纱布包好。

蒸煮:121℃蒸煮30 min，蒸煮好的花生和黄豆保持豆粒完整。

接种:将蒸煮好的原料自然冷却到80℃左右，接种纳豆芽孢杆菌发酵液，混匀，用纱布盖好。

发酵:将接种后的原料放入恒温培养箱，湿度大约在50%左右，40℃发酵约18 h。

后熟:封盖后于4℃冰箱放置24 h。

1．2．4 感官评定

由本院10名有经验的师生采用双盲法进行打分。对样品采用四位随机数字进行编码，样品排列顺序也随机［9］，评分标准见表1［10］。

表1 感官评分标准

1．2．5 氨基酸态氮的测定

甲醛滴定法［11］(取纳豆黏液为样品)。

1．2．6 多糖的测定

直接滴定法［12－13］。

1．2．7 氨基酸测定

精确称取1．000 0 g样品放入特制的玻璃水解管中，加入6 mol/L HCl 8 mL，抽真空，待真空度达到要求后维持10 min，封口，110℃水解22 h，冷却。用滤纸过滤，取滤液1 mL于10 mL烧杯中，60℃水浴，在真空干燥器中蒸干。将蒸干的样品，定量加入一定体积的0．02 mol/LHCl，在空气中放置30 min，用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸含量［14］。

1．3 数据处理

1．3．1 Plackett－Burman试验

Plackett－Burman试验从众多的影响花生纳豆发酵因素中快速有效的筛选出最为重要的几个因素供进一步研究［15］。N次试验设计最多可研究N－1个因素，其中至少有3个空白项以估计试验误差，每个因素取高低2个水平，高、低水平分别出现N/2次;当某个因素处于高(低)水平时，其余因素各出现高、低水平N/2次。各因素效应进行T检验，选择可信度较高的因素作为重要的因素进行下一步研究［16］。

1．3．2 最陡爬坡试验

最陡爬坡试验是根据影响花生纳豆发酵的各显著因素效应值的大小确定最陡上升路径，其他因素的取值根据各因素效应的正负和大小，正效应的因素均取较高值，负效应的因素均取较低值［16－17］。

1．3．3 Box－Behnken试验

Box－Behnken法每个因素取3个水平，以(－1，0，1)为编码，对数据进行二次回归拟合，得到二次方程，能够分析各因素的主效应和交互作用，最后在一定的条件下取得最佳值［15］。

2 结果与讨论

2．1 重要因素的筛选

利用Plackett－Burman试验设计筛选影响感官评分和氨基酸态氮的重要因素，选取了影响花生纳豆发酵的10个因素，包括黄豆与花生的质量比、接种量、蒸煮时间、浸泡时间、发酵时间、发酵温度和4个空白因素。每个因素取高低2个水平，高水平是低水平的1．25倍，以感官评分值和氨基酸态氮为响应值，3次重复试验，取平均值，结果见表2;以感官评分值和氨基酸态氮［18］为响应值的各因素效应、重要性评价，见表3。

表2 N=12的Plackett－Burman试验设计及响应值表

由表3可知，对花生纳豆感官评分值有显著影响(可信度均大于95%)的因素为黄豆与花生的质量比、浸泡时间、发酵温度、发酵时间和接种量，其中发酵时间影响最显著，其次是接种量，两个因素呈显著的正效应;对花生纳豆氨基酸态氮含量有显著影响(可信度均大于95%)的因素按重要性依次为接种量、发酵时间、黄豆与花生的质量比，3者均呈显著的正效应。

表3 Plackett－Burman试验因素水平及其主效应分析

2．2 最陡爬坡试验

结合表3试验结果，利用最陡爬坡试验确定最佳响应区域，在下一步试验中，选取接种量、发酵时间、黄豆与花生的质量比这3个因素，设定它们的变化方向和步长，其他因素取最低水平，试验结果见表4。

表4 最陡爬坡试验设计及结果

表4列出了各显著因素的变化方向、步长和试验结果。由表4知，感官总分和游离氨基酸态氮在第2组到第3组之间有一个上升，之后开始下降，第3组和第4组之间存在最优条件，所以选取第3组条件为后续Box－Behnken试验的中心点。

2．3 最佳发酵条件的确定

利用Box－Behnken试验设计选取(－1，0，1)3个编码水平，分别对应各因素的取值，见表5，试验结果见表6。

表5 3因素3水平取值表

根据表6的Box－Behnken试验结果，利用SAS9．1．3软件对结果进行二次回归分析，得到感官评分和氨基酸态氮对接种量、发酵时间、黄豆与花生的质量比的多元二次回归方程，同时得到响应面立体分析图(图1、图2)，可知，回归方程存在稳定点。

表6 N=15的Box－Behnken试验设计

以感官评分为响应值的回归方程为:

以氨基酸态氮为响应值的回归方程为:

模型的显著性检验表明［19］，失拟项大于F值的概率分别为0．195 6和0．074 8，失拟项不显著，两模型均显著，说明模型设计合理。另外，两组模型的复相关系数分别为91．55%和90．86%，表明两模型与实际情况拟合较好。以感官评分为响应值时，通过岭脊分析得知，当编码值分别为(0．206 4，－1．218 3，－0．152 9)，即接种量X1为3．10%，发酵时间X2为16．78 h，黄豆/花生X3为3．85时，感官评分最大为95．14;以氨基酸态氮含量为响应值时，当编码值分别为(0．413 47，0．188 45，0．890 80)，即接种量X1为3．21%，发酵时间X2为18．19h，黄豆/花生X3为4．89，最大值为0．583%。为了检验模型的准确性，再次进行验证试验，试验中结合实际情况取接种量3%，发酵18 h，黄豆与花生质量比4∶1，得到感官评分值为94．65分，氨基酸态氮质量分数为0．578%，与预测值接近。

2．4 产品质量指标

在最佳发酵条件下，即黄豆与花生的质量比为4∶1，在121℃蒸煮30 min，接种量3%，湿度50%左右，40℃发酵18 h，得到的花生纳豆具有良好的感官品质，金黄和乳白的诱人颜色，气味芳香，黏液量多，拉丝长，口感酥软。理化指标和游离氨基酸含量见表7和表8。

表7 理化指标

表8 氨基酸含量

续表

3 讨论与结论

花生纳豆的最佳发酵条件为黄豆与花生的质量比为4∶1，121℃蒸煮30 min，接种量3%，湿度50%左右，40℃发酵18 h，氨基酸态氮质量分数为0．583%。

花生纳豆具有光泽，气味芳香，口感酥软，黏液多，拉丝的长度达10个单位以上，且韧性强。

花生纳豆多糖含量高。多糖具有丰富的生物活性，有抗血栓、抗肿瘤、免疫促进和抗病毒等作用［20］，用直接滴定法测定花生纳豆多糖质量分数为7．20%，而同样方法测得传统纳豆多糖质量分数为6．08%。

花生纳豆营养及风味、口感均优于传统纳豆，适合我国人民的饮食习惯。花生纳豆的开发，对提高花生、黄豆的附加值，对我国纳豆产业的发展及全民健康都具有积极的意义。

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Optimization of Fermentation Process of Peanut－Natto by Response Surface Methodology

Qi Fengyuan Li Huanhuan Yang Li Wang Guoyang Ma Yong
(College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou Liaoning 121013)

Soybeans and peanuts were used as raw material to make peanut－natto and study its best making process conditions Filtering the most three important factors which affect fermentation of peanut－natto by Plackett－Burman experiment:the mass ratio，inoculum size and the fermentation time of soybean and peanuts;taking sensory evaluation and amino－acid nitrogen as indexes to determine the optimum fermentation conditions through steepest ascent experiment and Box －Behnken experiment．The result shows that the mass ratio of soybeans and peanuts as4∶1，steaming for 30 min at 121℃，inoculum size of 3%，fermenting for 18 h at 40℃ ．Peanut－natto is better than traditional natto in sensory quality and flavors．

peanut－natto，fermentation，sensory evaluation，amino －acid nitrogen

TS214．9

A

1003－0174(2012)10－0087－06

辽宁省教育厅——纳豆系列产品的开发与研制(2009 A035)

2012－01－06

齐凤元，女，1960年出生，教授，硕士生导师，食品资源开发与利用