双波长分光光度法测定木薯块根淀粉含量的动态变化

黄惠芳 罗燕春 田益农 付海天 苏文潘 彭靖茹 黎 萍 黄 强 侯学文

双波长分光光度法测定木薯块根淀粉含量的动态变化

黄惠芳1，2罗燕春1，2田益农1，2付海天1，2苏文潘1，2彭靖茹1，2黎 萍1，2黄 强1，2侯学文3

(广西壮族自治区亚热带作物研究所1，南宁 530001)
(广西壮族自治区木薯研究所2，南宁 530001)
(华南农业大学分子植物生理研究室3，广州 510642)

以双波长分光光度法测定SC201、SC205、GR891和GR911共4个木薯品种生育期块根中直链淀粉与支链淀粉含量的动态变化。结果表明，4个木薯品种块根直链淀粉的含量是随生育期的延长而逐渐增加的，而支链淀粉的含量却缓慢下降，支链淀粉/直链淀粉的比例呈现下降趋势，到12月份4个品种的这一比例已接近相同;以鲜重计的总淀粉含量，4个品种均呈逐渐增加的趋势;而以干重计的总淀粉含量的变化则4个品种表现不一致。研究初步揭示了木薯块根直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量的积累规律。

双波长分光光度法 木薯 直链淀粉 支链淀粉

木薯(Manihot esculenta L)是大戟科木薯属中唯一的栽培种，是热带、亚热带地区重要的粮食作物和经济作物，以块根的形式储存大量淀粉，木薯淀粉在淀粉食品、工业原料、生物能源等领域用途十分广泛［1－4］。木薯淀粉是由直链淀粉和支链淀粉构成，木薯淀粉的构成和含量对其收购价格影响很大，因此如何简便快速测定木薯支链淀粉、直链以及总淀粉的含量具有很强的实用意义。测定淀粉的方法很多，如旋光法、国标法、比色法、双波长法和多波长法、碘亲和力测定法、近红外法、排阻色谱分析法、差示扫描量热法、伴刀豆球蛋白法等［5－7］，但这些方法有的操作复杂，或者成本高，或者不能区分直链淀粉与支链淀粉，应用受到限制。而淀粉的双波长分光光度法则根据支链淀粉与碘生成棕红色复合物，直链淀粉与碘生成深蓝色复合物，它们的吸收光谱不同。通过直链淀粉与支链淀粉标准品经碘试剂处理后扫描获得各自的吸收光谱，运用作图法找到适合测定直链淀粉与支链淀粉的两种波长，并建立起直链淀粉与支链淀粉浓度与吸光度的标准曲线。对待测样品进行处理后，同时采用4种波长对其进行测定，就可分别求得直链淀粉与支链淀粉的含量，并进而求得总淀粉含量，本法具有简便快速、成本低的特点［8］，已成为植物淀粉测定的常用方法［9－13］。本研究采用此方法，测定了SC201、SC205、GR891和GR911等木薯品种全生育期直链淀粉、支链淀粉和总淀粉含量的动态变化，本试验结果有助于了解木薯块根支链淀粉、直链淀粉和总淀粉的积累规律，为选择恰当的木薯采收时机以获得期望的支链淀粉、直链淀粉、总淀粉含量以及支链淀粉/直链淀粉比例提供参考。

1 材料与方法

1．1 试验材料

1．1．1 材料的种植与采集

木薯SC201、SC205、GR891和GR911，均于2010年3月9日种植，株行距1×0．8 m，每小区7×11株，3个重复，随机区组设计。基肥:木薯淀粉渣3 t/ha，木薯专用肥1 250 kg/ha，追肥氯化钾450 kg/ha。

分别于当年7月9日、8月10日、9月8日、10月9日、11月8日和12月10日采样，采样时选取木薯3株，其中每小区1株，从中选有代表性的薯3条，从中部采样100 g，于烘箱105℃下灭酶活15 min，于75℃烘24 h至恒重，干重与鲜重的比率为干物质含量。木薯干片称重后立即粉碎，过60目筛，于脂肪抽提器脱脂6 h，于80℃烘箱中处理2 h，储存于封口袋并放置于干燥器中保存备用。

1．1．2 主要仪器与试剂

Lambda35紫外可见分光光度计:美国PerkinElmer公司;GR－200万分之一电子天平:日本A＆D公司;DHG－9076A电热恒温鼓风干燥箱:上海精宏实验设备有限公司;HH－S4数显恒温水浴锅:江苏金坛市医疗器械厂;DFT－100万能粉碎机:温岭市林大机械有限公司;索氏抽提器等;马铃薯直链淀粉与支链淀粉标准品:美国Sigma公司;其余常规试剂石油醚、无水乙醇、氢氧化钾、盐酸、碘、碘化钾均为国产分析纯试剂。

碘试剂的配制，称取碘化钾2．0 g，溶于少量蒸馏水，再加碘0．2 g，待溶解后用蒸馏水定容至100 mL，贮于棕色瓶中备用。

1．2 试验方法

1．2．1 支链淀粉与直链淀粉标准溶液配制与测定波长的确定

参考金玉红等［9］方法，具体操作如下:称取0．100 0 g直链淀粉纯品，放在100 mL容量瓶中，加少量无水乙醇湿润，加入1 mol/L KOH 10 mL，在75℃热水浴中溶解后，取出加蒸馏水定容至100 mL，混匀，即为1 mg/mL直链淀粉标准溶液。取标准溶液0、0．3、0．5、0．7、0．9、1．1、1．3 mL放入50 mL容量瓶中，加入20～30 mL蒸馏水，以0．1 mol/L盐酸调至溶液pH 3．5，加0．5 mL碘试剂，并用蒸馏水定容至刻度，混匀得浓度为0、6、10、14、18、22、26μg/mL的标准溶液系列。按上述方法制备1 mg/mL支链淀粉标准溶液，取支链淀粉标准溶液0、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0 mL同法配制浓度为0、40、50、60、70、80、90、100μg/mL的标准溶液系列。

将用碘试剂处理的26μg/mL直链淀粉和100 μg/mL支链淀粉标准溶液分别在紫外－可见光分光光度计上进行400～1 000 nm波段光谱扫描，分别获得二者的吸收光谱图，用作图法分别获得支链淀粉与直链淀粉的测定波长与参比波长。

1．2．2 直链淀粉标准曲线绘制

将上述配制的直链淀粉标准溶液在λ1和λ2两波长下分别测定吸光度Eλ1、Eλ2，即得:ΔE值=Eλ1－Eλ2。以ΔE值为横坐标，直链淀粉浓度为纵坐标，即得双波长直链淀粉标准曲线。

1．2．3 支链淀粉标准曲线绘制

将上述配制的支链淀粉标准溶液分别在λ3和λ4两波长下分别测定其吸光度Eλ3、Eλ4，即得:ΔE值=Eλ3－Eλ4。以ΔE值为横坐标，支链淀粉浓度为纵坐标，即得双波长支链淀粉标准曲线。

1．2．4 双波长法测定木薯块根中淀粉含量

称取脱脂木薯淀粉样品0．1 g左右，加少量无水乙醇湿润，加1 mol/L KOH 10 mL，在热水浴中振荡15 min取出，在75℃热水浴中溶解后，以蒸馏水定容至50 mL，静置20 min。分别吸取3 mL作为样品测定液和样品空白液，均加入20～30 mL蒸馏水，以0．1 mol/L HCl调pH至3．5左右，在样品测定液中加碘试剂0．5 mL，将样品测定液和样品空白液定容至50 mL混匀，静置20 min，以样品空白液为对照，用分光光度计测定样品溶液在λ1、λ2、λ3、λ4这4个波长条件下的吸光度，根据直、支链淀粉的双波长标准曲线算出样品的直、支链淀粉含量，二者相加求得样品总淀粉含量。图表中数据均为3次测定的平均值。

1．2．5 数据处理

数据处理采用2003版Excel和7．05版DPS软件，绘图采用2003版Excel软件。图中误差线是标准误差，图中标注的不同大写字母表示在1%水平上差异显著。

2 结果与分析

2．1 4个木薯品种生育期干物质含量变化趋势

从图1可以看出，4个木薯品种块根干物质含量是逐渐增加的，其中GR891的干物质含量一直是最高的;而SC201、GR911的干物质含量最低。

图1 4个木薯品种生育期块根干物质含量变化趋势

2．2 双波长法测定波长的选取

图2是支链淀粉与直链淀粉标准品经碘试剂处理后在400～1 000 nm的吸收光谱图，根据双波长法的原理得直链淀粉测定波长为λ1(633 nm)，参比波长为λ2(493 nm)，支链淀粉测定波长为λ3(557 nm)，参比波长为λ4(744 nm)。

图2 支链淀粉、直链淀粉测定波长与参比波长的选取

2．3 支链淀粉与直链淀粉标准曲线的建立

以测定波长为λ1(633 nm)，参比波长为λ2(493 nm)的OD值差值为横坐标，直链淀粉浓度为纵坐标，获得了直链淀粉的标准曲线(图3)，其拟合方程为y=64．308x+0．120 3，R2=0．999 7，说明标准曲线制作良好，直链淀粉质量浓度在30μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

图3 直链淀粉标准曲线

以测定波长为λ3(557 nm)，参比波长为λ4(744 nm)的OD值差值为横坐标，支链淀粉浓度为纵坐标，获得了支链淀粉的标准曲线(图4)，其拟合方程为y=347．64x+1．908，R2=0．995 2，说明标准曲线制作良好，支链淀粉质量浓度在100μg/mL范围内呈现良好的线性关系。

图4 支链淀粉标准曲线

2．4 4个木薯品种生育期淀粉含量变化趋势

图5是以干物质计4个品种直链淀粉的变化趋势，在7到11月份，4个品种的直链淀粉含量基本是逐渐增加的，其中7月到8月间增加显著，说明这一时间段是直链淀粉快速积累期。在11月到12月4个品种直链淀粉含量略有下降，但二者差异不大，说明直链淀粉的合成基本停滞。从不同品种间来看，公认的高粉品种GR891和SC205在整个测定周期均比GR911和SC201的直链淀粉含量高，在多数月份达到极显著差异。

图5 4个木薯品种生育期干物质中直链淀粉含量变化趋势

图6是以干物质计4个品种支链淀粉的变化趋势，可以看出在4个品种中，支链淀粉的含量均是呈现缓慢下降的趋势，再结合图5直链淀粉是上升的趋势，可以推测在这一时期直链淀粉的合成速度是快于支链淀粉的。从不同品种间来看，GR891的直链淀粉含量要明显高于其他3个品种。

图6 4个木薯品种生育期干物质中支链淀粉含量变化趋势

图7 是以干物质计4个品种总淀粉的变化趋势。从不同品种间来看，两个公认的高粉品种GR891、SC205在测定开始时，总淀粉质量分数就很高，分别为(71．00±0．35)%、(68．28±0．33)%，在12月份时分别明显下降为(63．89±2．61)%、(56．44±0．32)%。而两个低粉品种GR911、SC201在7月份测定开始时淀粉质量分数就比较低，分别为(52．08±0．46)%、(50．20±0．29)%，在生育期中总淀粉含量经历上升与下降的震荡变化，在12月份收获时其淀粉含量与7月份没有差异。

图7 4个木薯品种生育期干物质中总淀粉含量变化趋势

图8 是以鲜重计4个品种总淀粉的变化趋势，从图8中可以看出，4个品种的鲜重淀粉含量均是逐渐上升的。从不同品种间来看，两个高粉品种GR891、SC205的鲜重淀粉含量均比GR911、SC201的高，特别是GR891表现更为突出，在8月到12月显著高于其他3个品种。

图8 4个木薯品种生育期鲜重中总淀粉含量变化趋势

图9 是4个品种支链淀粉/直链淀粉比例的变化情况，从图9中可以看出，4个品种的这一比例均是逐渐下降的，这一结果再次表明，木薯块根在7月至12月间直链淀粉的合成速度要快于支链淀粉。从不同品种间来看，SC201在7月份的支链淀粉/直链淀粉比例达20．8倍，远高于GR891的11．5倍、GR911的12．9倍和SC205的9．8倍，但到8月份这一比例快速下降，随后这一比例持续缓慢下降，到11与12月份时4个品种的比例基本接近，已经没有差异。

图9 4个木薯品种生育期支链淀粉/直链淀粉变化趋势

3 结论

在试验中采用双波长分光光度法研究了4个木薯品种生育期中支链淀粉直链淀粉、总淀粉以及支链淀粉/直链淀粉比例的变化动态。结果表明在整个生育期，直链淀粉在总淀粉中的含量是逐渐上升，而支链淀粉在总淀粉中的含量是逐渐降低的，导致支链淀粉/直链淀粉的比例逐渐下降。以鲜重计的总淀粉含量在整个生育期4个品种均是逐渐上升的，但以干重计的总淀粉含量则变化相对比较平稳。虽然淀粉积累的变化趋势在4个品种中均相同，但在含量水平上4个品种间还是具有明显差异，比如公认的高粉品种GR891在支链淀粉含量、总淀粉含量方面明显高于其他3个品种，而在直链淀粉含量方面与另一高粉品种SC205比较接近，但均高于GR911和SC201。品种SC201在10月份前其支链淀粉/直链淀粉的比例均显著高于其他3个品种，但在11月份后4个品种间已经没有差异，这些结果说明这4个品种间直链淀粉、支链淀粉的积累速率是有差异的。研究结果为栽培时品种选择、收获时机选择提供了参考。

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Time Course of Starch Content in Cassava Root Tuber Determined by Dual－Wavelength Spectrophotometry

Huang Huifang1，2Luo Yanchun1，2Tian Yinong1，2Fu Haitian1，2Su Wenpan1，2Peng Jingru1，2Li Ping1，2Huang Qiang1，2Hou Xuewen3
(Subtropical Crops Research Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region1，Nanning 530001)
(Cassava Research Institute of Guangxi Zhuang Autonomous Region2，Nanning 530001)
(Lab of Molecular Plant Physiology，College of Life Sciences，South China Agricultural University3，Guangzhou 510642)

The time course of amylase and amylopectin content in root tuber of four cassava cultivars，SC201，SC205，GR891and GR911，were determined by dual－wavelength spectrophotometry．The results showed that:the amylose content of cassava root tuber of four cultivars gradually increase in the time course，however the amylopectin decreased along with the growth period，and the ratios of amylopectin/amylose of four cultivars were decreased continuously，by December，their ratios were very close to 1∶1．The starch content by fresh weight in four cultivars also increased，while the starch content by dry weight in four cultivars were different．This research revealed the accumulation rule of amylose，amylopectin and total starch of cassava root tuber．

dual－wavelength spectrophotometry，cassava，amylose，amylopectin

S533

A

1003－0174(2012)10－0113－05

广西主席基金(09203－03)

2012－01－04

黄惠芳，女，1969年出生，高级工程师，植物生物化学研究

黄强，男，1967年出生，高级农艺师，生物技术、品种引进

侯学文，男，1969年出生，研究员，博士研究生导师，植物生物技术