呼吸机相关性肺炎患者细菌病原的对比研究

王芳，韩春华，宋振凤，曲政海

(青岛大学医学院附属医院儿科，山东青岛266000)

呼吸机相关性肺炎患者细菌病原的对比研究

王芳，韩春华，宋振凤，曲政海

(青岛大学医学院附属医院儿科，山东青岛266000)

目的探讨呼吸机相关性肺炎患者细菌病原特点。方法选取确诊呼吸机相关性肺炎的患者85例为研究对象，将所获下呼吸道分泌物为标本，留标本一分为二，一份于30分钟内行分离培养加药敏检测；另一份置-80℃冰箱保存，集中进行多重PCR检测。采用多重PCR方法检测5种呼吸机相关性肺炎常见细菌病原菌的阳性率及分布情况。结果常规分离培养呼吸机相关性肺炎患者检出21株致病菌，阳性率为24.7%（21/85）,G-菌占85.7%（18/21）；多重PCR检测呼吸机相关性肺炎患者检出69株致病菌，阳性率为81.2%（69/85），G-菌占89.9%（62/69）。标本采集前有71.7%（61/85）的患者采用了抗生素治疗，分离培养阳性率为11.5%(7/61),多重PCR阳性率为80.3%（49/61）。结论呼吸机相关性肺炎患者下气道感染病原以革兰氏阴性菌为主；多重PCR检测的阳性率高于分离培养，这在已使用抗生素治疗的患者中尤为有效，可以作为分离培养的有利补充。

呼吸机相关性肺炎；分离培养；多重PCR；病原菌

呼吸机相关性肺炎(ventilatorassociated pneumonia,VAP)是机械通气患者最主要的医院获得性感染，也是最常见、最严重的医院获得性肺炎，是重症监护室（Intensive Care Uint，ICU）患者的主要死因。据报道，VAP发病率国内为6%～52%[1],国外最高达76%[2]，病死率25%～76%[1]。患者一旦发生VAP，极易出现脱机困难,造成住院时间延长,住院费用增加，严重者危及生命。VAP患者的病原学往往非常复杂，常为混合感染。为有效治疗VAP,明确病原是首要问题。本文通过对ICU中VAP患者的下气道分泌物进行分离培养及多重PCR检测，了解其细菌病原分布特点，同时评价多重PCR检测的准确性，探讨多重PCR检测在VAP患者病原诊断中的应用价值，现报道如下。

1临床资料

1.1试剂与仪器NaOH，注射用灭菌生理盐水，Tris，EDTA，无水乙醇，Loadingbuffer，蛋白酶K，细菌DNA提取试剂盒等（由宝泰克公司提供，PCR引物，TaqDNA聚合酶等由大连生物公司提供）；低温离心机，核酸蛋白分析仪由美国Beckman公司提供PCR仪由德国Eppendorf公司提供；凝胶成像仪由德国Albert公司提供。

1.2研究对象选取2012年7月—2013年3月期间我院ICU确诊VAP患者85例，其中男52例,女33例,年龄26～81岁,平均46.5岁。选取的患者第一诊断分别为：心力衰竭8例；肾病综合征合并大量胸腔积液3例；颅内出血10例；溺水2例；急性胰腺炎2例；药物中毒8例；急性肺损伤6例；肺癌肺叶切除术后5例；肿瘤晚期8例；复合外伤17例；昏迷3例；糖尿病1例；系统性红斑狼疮1例；一氧化碳中毒1例。选取标准符合VAP诊断标准[3]，即：使用机械通气( MV)48 h后或撤机拔管48 h内X线胸片,出现新的或进行性增大的肺部浸润性阴影,肺部实变体征和(或)可闻及湿啰音,同时具备下列条件之一：1)外周血白细胞总数增高(WBC＞10.0×109/L)。2)体温＞37.5℃。3)呼吸道有脓性分泌物。4)从支气管分泌物中分离出新的病原菌。

1.3标本采集用一次性无菌吸痰管连接灭菌密闭容器，经气管插管抽吸下气道分泌物标本共85份。将收集的下气道分泌物的标本分成2份，一份于30分钟内送检验科细菌室行培养加药敏检测；另一份置-80℃冰箱保存，集中行多重PCR检测。

1.4检测方法

1.4.1分离培养+药敏将收集到的下气道分泌物以无菌接种环接种到哥伦比亚巧克力平板、哥伦比亚血平板和斯氏平板上，铺满90mm平皿，分别放在二氧化碳、有氧及厌氧环境下生长35℃,18～72 h，每18 h记录一次，厌氧菌培养采用气袋法，72 h以后观察记录。菌株鉴定及药敏试验严格按照《全国临床检验操作规程》进行培养、鉴定，药敏采用KB纸片扩散法，结果按照美国临床实验标准委员会（NCCLS）标准判断。

1.4.2多重PCR检测引物的设计：根据GenBank基因序列已公布的SA Nuc基因、EC 16S-RNA基因、Ab OXA-51基因、KPN 16S-RNA基因、PA gyrb基因间隔区基因序列，通过分子生物学DNAStar、Primer Premier 5.0软件(Premier Biosoft Inc,Canada)和BLAST软件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)分析后设计5对引物。5种细菌多重PCR引物序列如下：1）鲍氏不动杆菌(Ab)靶基因为OXA-51，引物（5’-3’）为F：CTCGTGCTTCGACCGAGTAT、R：AACCAACACGCTTCACTTCC。2）铜绿假单胞菌(PA)靶基因为Gyrb，引物（5’-3’）为F：CCTGACCATCCGTCGCCACAAC、R：CGAAGCAGGATGCCGACGCC。3）金黄色葡萄球菌（SA）靶基因为Nuc引物（5’-3’）为F：CATTGGTTGACCTTTGTACATTAA、R：GATGGAAAAATGGTAAACGAAG。4）肺炎克雷白杆菌(KPN)靶基因为16S-RNA，引物（5’-3’）为F：ATTTGAAGAGGTTGCAAACGA、R：TTCACTCTGAAGTTTT CTTGTGTT。5）大肠杆菌(EC)靶基因为16S-RNA，F：AATGGCGCATACAAAGAGAAGC、R：GTTGCAGACT CCAATCCGGA。

1.4.3标本的处理及细菌DNA的提取先将标本在室温下解冻，然后加入4%的NaOH 1～1.5mL静置15min，将其消化液化；离心10,000 rpm，10min，弃上清；加入无菌生理盐水1mL，混匀，10,000 rpm离心，5min，弃上清；再次加无菌生理盐水1mL，混匀，10, 000 rpm，离心5min，弃上清；将所得沉淀物用细菌DNA提取试剂盒提取DNA。

1.4.4多重PCR检测确立多重PCR的反应体系为50μL，包括Premix ExTaq 25μL,各引物对（20 uM）各1μL，模板（根据每个标本DNA浓度的不同，确定其总量），以灭菌蒸馏水补足50μL。以双蒸水替代DNA作为阴性对照模板，以目标检测菌株（SA、KPN、EC、Ab、PA）的DNA作为阳性对照模板。反应体系为：94℃预变性10min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10min。将多重PCR反应产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，于BIORAD凝胶成像系统下拍摄成像并观察结果。

1.5统计学分析应用SPSS17.0统计学软件，计数资料进行χ2检验。

2结果

2.1标本分离培养结果21例标本细菌培养阳性，阳性率为24.7%（21/85）。其中金黄色葡萄球菌两株；鲍氏不动杆菌3株；大肠杆菌6株；铜绿假单胞菌3株；肺炎克雷白杆菌4株；洋葱伯克霍尔德菌1株；嗜麦芽窄食单孢菌1株；屎肠球菌1株；白假丝酵母菌1株；其中1例患者同时培养出金黄色葡萄球菌和洋葱伯克霍尔德菌，两株金黄色葡萄球菌中1株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

2.2标本多重PCR结果69例标本检出病原菌，阳性率为81.2%（69/85）。其中，金黄色葡萄球菌10株，鲍氏不动杆菌15株；大肠杆菌20株；铜绿假单胞菌12株；肺炎克雷白杆菌15株。包括3例患者同时检出2种病原菌：2例同时检测出大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；1例同时检测出肺炎克雷白杆菌和金黄色葡萄球菌。

2.3病原菌检出情况对比本研究中标本多重PCR与标本细菌培养对金黄色葡萄球菌（SA）、鲍氏不动杆菌(Ab)、大肠杆菌（EC）、铜绿假单胞菌(PA)及肺炎克雷白杆菌(KPN)的对比检出情况见表。其中多重PCR对SA、Ab、EC、PA及KPN的检出率分别为：11.8%（10/85）；17.6%（15/85）；23.5%(20/85)；14.1% (12/85)；17.6%(15/85)。SA、Ab、EC、PA及KPN细菌培养阳性分别为：2例、3例、6例、3例、4例。多重PCR对SA、Ab、EC、PA及KPN细菌培养阳性比较P均＜0.05。

2.4多重PCR的特异性与敏感性分析多重PCR对五种细菌病原的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值见表1。敏感性=多重PCR与细菌培养检测共同阳性例数/细菌培养检测阳性例数×100%，特异性=多重PCR与细菌培养检测共同阴性例数/细菌培养检测阴性例数×100%，阳性预测值=多重PCR与细菌培养检测共同阳性例数/多重PCR阳性例数× 100%，阴性预测值=多重PCR与细菌培养检测共同阴性例数/多重PCR阴性例数×100%。

表1 多重PCR检测标本中五种病原体的敏感性与特异性分析（例,%）

2.5抗生素的应用对检出率的影响留取标本前使用过抗生素的61例（71.8%）患者，标本分离培养检出7株致病菌，其中铜绿假单胞菌1例（1.6%）、大肠杆菌3例（4.9%）、肺炎克雷伯杆菌2例（3.3%）及白假丝酵母菌1例（1.6%）；多重PCR检出49株致病菌，其中金黄色葡萄球菌5例（8.2%）、鲍氏不动杆菌9例（14.8%）、铜绿假单胞菌9例（14.8%）、大肠杆菌14例（23.0%）及肺炎克雷伯菌杆菌12例（19.7%）。多重PCR与分离培养比较P＜0.01。

3讨论

目前报道有关VAP患者的病原学检查主要以培养为主，通常耗时至少3 d左右，且操作繁琐、所受影响因素多，尤其受早期应用抗菌药物影响较大。近年来，随着分子生物学迅速发展，在分子及基因水平上诊断致病菌，已成为病原学诊断的研究热点。常用的分子生物学方法有PCR、探针杂交法和单链构象多态性等。其中PCR方法从DNA提取到获取结果所需时间不到2 h，与传统的病原菌培养方法相比具有极大的优势，对早期明确病原菌十分重要。普通PCR只是针对一种病原菌的检测方法，而多重PCR技术可利用较少的试验成本同时检测多个核酸样本，同时可大大的节省检测时间和经费开支。

对VAP患者下气道分泌物行分离培养的同时对同一标本进行多重PCR检测，结果显示病原菌均以革兰氏阴性菌为主，这也与国内外许多学者得到的结果相同[4-5]。选取了大肠杆菌（EC）、铜绿假单胞菌(PA)、肺炎克雷白杆菌(KPN)、金黄色葡萄球菌（SA）及鲍氏不动杆菌(Ab)做为检测菌株，主要是结合前期分离培养结果与已报道的VAP患者的常见病原谱[4-5]，同时这也与研究中标本的细菌培养结果相符。多重PCR较传统细菌培养在VAP患者下气道分泌物大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白杆菌、鲍氏不动杆菌及金黄色葡萄球菌的检出方面的有显著性差异，提示多重PCR在以上病原菌的检查方面较细菌培养具有优势；同时多重PCR技术在检测以上各病原菌的敏感性均为100%，即传统分离培养获取的病原菌通过多重PCR技术完全可以检出，这也提示多重PCR在检测VAP患者下气道分泌物病原菌方面具有一定的可信度。

对于一种新的诊断方法来说，最大难题是与常规的传统方法相比较，如何评价其敏感性。本研究证实多重PCR对金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌及铜绿假单胞菌的诊断的敏感性均可达100%，且对五种病菌检测的特异性均较高。另外，疾病发生率的高低对其预测值的大小起决定性作用。由于本研究中的5种病原体是引起VAP感染最常见的病原菌，加上多重PCR具有很高的阴性预测值，这也与国外相关报道相一致[6]，而多重PCR阴性结果的价值在于可以在临床上早期用于排除这些病原体。

在样本采集前有71.7%的患者采用了抗生素治疗。已应用抗生素治疗的患者的下气道分泌物多重PCR检测与标本细菌培养相比，多重PCR具有更高的检出率。因此，当已应用抗生素治疗的患者的标本细菌培养物出现假阴性结果时可以用多重PCR进一步检测。另外，研究中由于大量患者标本采集前已使用过抗生素治疗，金黄色葡萄球菌、鲍氏不动杆菌等作为VAP感染的标本细菌培养病原学诊断率很低，同时在检测已应用抗生素治疗的患者的病原菌阳性例数方面，多重PCR检测与传统的标本细菌培养相比差异具有统计学意义，这都证明多重PCR能很好的指导相关治疗[7]。

尽管如此，多重PCR在实际应用中也存在一定不足。PCR有较高的灵敏度，操作过程必须严格实验步骤，稍有污染就会造成假阳性；多对引物同时扩增，各种实验条件如果控制不当，很容易导致扩增的失败或产生非特异性产物[8]；且引物的设计、靶序列的选择不当都可能降低其灵敏度和特异性。此外虽然一次多重PCR中实现多次的常规PCR，理论上引物对的数量不限，但目前的研究受到检测病原菌种类、模板的类型及实验仪器等多种因素限制，备检病原菌无法做到无限制的增加，目前可检索到病原体种类仍有限。另外多重PCR技术仍不能做到像传统分离培养一样作出药敏诊断且不同的DNA提取方法也可能使反应结果有所不同[9]。

多重PCR检测技术具有无可比拟的优越性，大量的单个技术已改为多重扩增来进行遗传代谢性疾病和感染性疾病的诊断，其在科研和临床领域都将会有更好的应用。随着多重PCR方法在感染性疾病病原诊断中的应用，我们希望越来越多的VAP患者能尽早确定病原菌，尽早治疗，以期待减少VAP的病死率。

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Con trastive Study of Pathogens in Patien tsw ith Ven tilator-associated Pneum onia

W ang Fang，Han Chunhua，Song Zhenfeng，Qu Zhenghai
（Affiliated HospitalofQingdao University MedicalCollege,Qing dao 266000,Shandong）

ObjectiveIn order to study the pathogen distribution of lower respiratory tractof adult ICU ventilatorassociated pneumonia（VAP）patients and discuss the diagnostic value ofmultiplex PCR in bacterial pathogens of VAP patients,secretion of lower respiratotractwas isolated and detected bymultiplex PCR.Methods85 samples of lower respiratory tract secretion from diagnosed VAP patients in ICU ward were collected,and each sample was divided to two,so all the sampleswere seperated into two parts.One partwere sent to laboratory room to isolate and culture bacteria and test drug sensitivity in 30m inutes.Another part sampleswere saved in-80℃refrigerator,and then were tested by multiplex PCR.The positive rate and the distribution of 5 kinds of common bacterial pathogens(Staphylococcus aureus, Escherichia coli,K lebsiella pneumoniae,Pseudomonas aeruginosa,Acinetobacter baumannii)in VAPwere analyzed.Resu lts Conventional isolation and culturewere used,and 21 strains of pathogenic bacteriawere detected in VAP patients. The positive ratewas 24.7%(21/85),and Gram-negtive bacteria positive ratewas 85.7%(18/21).69 strains of pathogenic bacteriawere detected positive in VAP patients usingmultiplex PCR.The positive rate was 81.2%（69/85）,and Gramnegtive bacteria positive rate was 89.9%(62/69).71.7%(61/85)patients w ith VAP were treated w ith antibiotics before sample collection,the positive rate of isolation and culture was 11.5%(7/61),while the positive rate ofmulti plex PCR was 80.3%(49/61).Conclusions Both bacteria culture andmultiplex PCR detection secretions of VAP patients lower respiratory tractaremainly gram-negtive bacteria,and the pathogenic bacteria positive rate ofmultiplex PCR is higher than thatof isolation and culture,especially in the pretreated w ith antibiotics.Therefore,multiplex PCR can be used as the supplementof isolation and culture.

v entilatorassociated pneumonia(VAP);isolation and culture;multiplex PCR;pathogenic bacteria

R563.11

：A

：1008-4118（2013）03-0001-04

10.3969/j.issn.1008-4118.2013.03.01

2013-06-

王芳(1982-)，女，医学硕士，主治医师，工作单位：青岛大学医学院附属医院黄岛分院儿科。

曲政海，男,quzhenghai@163.com。