丙型肝炎病毒核心蛋白上调基质金属蛋白酶组织抑制因子-1的表达

王巧侠，李文凡，成 军

1.西安市中心医院感染科，陕西 西安 710003;2.甘肃省人民医院消化科;3.北京地坛医院传染病研究所

丙型肝炎病毒(HCV)是慢性肝炎的主要致病因子之一，全世界约有一亿七千万人受到感染，HCV的感染很容易持续存在，造成肝脏慢性炎症，导致肝脏纤维化以及肝硬化。目前认为，HCV 进入肝细胞后，病毒基因组及其编码的蛋白与肝细胞基因与蛋白之间的相互作用，是决定HCV 复制、表达、免疫逃逸、慢性感染、肝纤维化以及致HCC(肝细胞肝癌)的关键因素之一［1］。其中核心蛋白作为一种多功能蛋白质，能够影响多种细胞信号转导途径，激活多种病毒及细胞基因启动子，调控多种基因的转录［2］。基于以往的研究成果，我们推测HCV 核心蛋白可能参与了细胞外基质合成与降解的调控，从而影响着肝纤维化、肝硬化的发生、发展。本研究通过观察HCV 核心蛋白对TIMP-1表达的影响，以探讨HCV 核心蛋白的致肝纤维化机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肝癌细胞系HepG2 细胞、人肝星状细胞系LX-2 细 胞、PcDNA3.1 (－)-HCVcore 质 粒、pCAT3-TIMP-1P 质粒及大肠杆菌DH 5α 菌株为北京地坛医院传染病研究所保存。Tag DNA 聚合酶、T4 DNA 连接酶及限制性内切酶均购自Takara 公司。质粒DNA 提取试剂盒，中间载体pGEM-Teasy及报告质粒pCAT3-Basic 均购自Promega 公司;CAT-ELISA 检测试剂盒及质粒DNA 转染试剂盒购自Roche 公司。玻璃奶纯化试剂盒购自博大公司，其他生化试剂购自Sigma 公司。DNA 序列测定由上海诺华公司完成。

1.2 pCAT3-TIMP-1 报告载体的构建 根据参考文献［3］，设计合成一对寡核苷酸引物，上游引物P1:5'-GCTAGCAGAACCGGTACCCATCTCAG-3'。下游引物P2:5'-CTCGAGCTGTACCTCTGGTGTCTCTC-3'，在上下游引物的5'-端分别引入NheI和XhoI 单一酶切位点(划线部分)，以HepG2 细胞基因组DNA为模板，PCR扩增TIMP-1 基因启动子DNA 片段。反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性1 min、65℃褪火1 min、72℃延伸1 min，循环35次，72℃保温10 min。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增结果。玻璃奶法回收纯化PCR 产物。回收产物与pGEM-Teasy中间载体连接，转化感受态DH5α 大肠杆菌，挑取在含有氨苄西林钠的选择平皿上生长的白色菌落提取质粒。酶切(KpnⅠ/MluⅠ)鉴定后，Kpn Ⅰ/Mlu Ⅰ双酶切重组质粒pGEMTeasy-TIMP-1P，玻璃奶纯化回收酶切产物，DNA测序鉴定无误后定向克隆至pCAT3-basic 载体，构建成重组质粒pCAT3-TIMP-1p，经NheI和XhoI 双酶切鉴定。磁珠法提取质粒以备转染。

1.3 pCAT3-TIMP-1 报告载体转录活性的鉴定 在35 mm 培养皿中常规培养HepG2 细胞，细胞生长至50%～80%融合时瞬时转染pCAT3-TIMP-1P 1μg，同时以转染pCAT3-basic的HepG2 细胞作阴性对照，以转染pCAT3-promoter的HepG2 细胞作阳性对照。转染48 h 后，收集细胞裂解液，用于CAT 活性检测。

1.4 CAT 表达水平的检测 按照试剂盒说明书进行。取1.0 ng/ml的CAT 标准品(试剂盒提供)及细胞裂解液200μl 加入已包被抗体的96 孔板中，37℃温育1 h，再依次加入第一抗体(地高辛标记的抗-CAT)、第二抗体(偶联有过氧化物酶的地高辛抗体anti-DIG-POD)各200μl，37℃温育1 h 后，加入过氧化物酶的底物室温显色10～30 min。用酶标仪测量标本在波长415 nm 处的吸光度值，其数值反映细胞提取物中的CAT 表达水平。以未作转染的细胞裂解液作空白对照进行平行实验。

1.5 pCAT3-TIMP-1P 与PcDNA3.1(－)-HCVcore质粒共转染实验 pCAT3-TIMP-1P、PcDNA3.1(－)-HCVcore各1μg 以脂质体法共转染LX-2 细胞，同时以转染pCAT3-basic的LX-2 细胞作阴性对照，以转染pCAT3-promoter的LX-2 细胞作阳性对照。转染48 h后，收集细胞裂解液，检测CAT 活性。所有实验严格平行操作。

2 结果

2.1 pCAT3-TIMP-1P 重组质粒的鉴定 PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析显示扩增片段约800 bp(见图1)。DNA 测序结果与基因库中TIMP1 启动子序列比对，扩增片段位于TIMP-1 启动子974～1774 bp。构建的pCAT3-TIMP-1p 重组质粒经转化感受态DH5α 细菌后，进行菌落PCR，PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳，显示扩增片段约为800 bp，符合预期大小，无非特异性扩增现象。提取的质粒应用NheI和XhoI酶切鉴定，结果表明TIMP-1P DNA 与pCAT3-Basic 报告基因载体正确连接(见图2)。

图1 TIMP-1p PCR 扩增 M:2 000 bp marker;1:TIMP-1p PCR 产物;图2 Pcat3-TIMP-1p 双酶切鉴定(NheI/XhoI)Fig 1 TIMP-1p PCR amplification M:2 000 bp marker;1:TIMP-1p PCR product;Fig 2 Idengified Pcat3-TIMP-1p by NheI/XhoI

2.2 pCAT3-TIMP-1P 启动子活性的鉴定 pCAT3-TIMP-1p 转染入HepG2 细胞后，以ELISA 法进行检测，结果显示pCAT3-basic的吸光度值为0.004±0.002，pCAT3-promoter为2.029±0.650，pCAT3-TIMP-1p为2.329±0.685，各组差异有统计学意义(F=26.075，P＜0.05)，LSD 法两两比较均显示P＜0.05，提示pCAT3-TIMP-1p 在HepG2 细胞中能够启动CAT的表达，具有较强的启动子活性(见表1)。

表1 Pcat3-TIMP-1p 重组质粒转染HepG2的CAT 吸光度值Tab 1 The OD of Pcat3-TIMP-1p after transfecting HepG2

2.3 PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p共转染后报告基因CAT 表达活检的检测 PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p 共转染LX-2 细胞后，pCAT3-TIMP-1p 吸光度值为0.833±0.040，同期单独转染LX-2 细胞的pCAT3-TIMP-1p 吸光度值为0.677± 0.049，pCAT3-basic为0.193± 0.090，pCAT3-promoter为0.354±0.052，方差分析F=132.401(P＜0.05)，各组差异有统计学意义(见表2)，LSD 法两两比较均显示P＜0.05，提示PcDNA3.1(－)-HCVcore与pCAT3-TIMP-1p 共转染后，pCAT3-TIMP-1p的表达增加(见表2)。说明HCV 核心蛋白能够上调TIMP-1启动子的转录活性。

表2 PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p 共转染LX-2的CAT 吸光度值Tab 2 The OD of PcDNA3.1(－)-HCVcore and Pcat3-TIMP-1p cotransfect LX-2

3 讨论

肝纤维化和肝硬化是连续的发展过程。在致病因子的作用下由于肝脏的持续炎症活动，肝纤维化进一步发展破坏了正常的小叶结构，假小叶和再生结节形成，则进入肝硬化。阻断、抑制甚至逆转肝纤维化是治疗慢性肝病的重要目标之一。因此，研究肝纤维化和肝硬化的发生、发展机制有着深远的意义。

肝纤维化发生的始动步骤在于肝星状细胞(HSC)的激活。HSC 激活后，一方面通过增殖使细胞数量增加;另一方面单个HSC 合成细胞外基质(ECM)的能力增强，使ECM的量和质均发生显著变化。以胶原为主的ECM 成份可较正常肝增加3～8 倍;各型胶原之间、糖蛋白之间及蛋白多糖之间的比值也出现异常［4］。而肝脏ECM的代谢主要由基质金属蛋白酶(MMPs)及其天然抑制剂-TIMPs 调节，MMPs 几乎能降解ECM的所有成分，而TIMPs 通过与MMPs 成员结合成复合物而抑制其活性，阻止ECM的降解，从而形成和促进肝纤维化。在肝纤维化早期，MMPs 酶解活性较为活跃，持续地降解正常基底膜，破坏肝脏的正常结构。ECM的成份和三维空间结构的改变又进一步刺激HSC 活化，调节HSC的形态、增殖及胶原合成［5］，并使HSC 持续激活并维持活化状态。随着肝纤维化的发展，HSC 完全活化，大量合成ECM和TIMPs，TIMPs 进行性升高，与MMPs 特异性结合，使后者酶解活性显著下降，基质降解被抑制，ECM 在细胞外沉积增加，形成纤维化［6］。因而，学者们认为TIMPs 是肝纤维化发展过程中的一个非常重要的促进因素［7］，目前在肝脏中主要有TIMP-1、TIMP-2 表达。TIMP-1可以结合除MMP-14、MMP-19 以外的所有MMP，并使其活性减弱，主要是抑制MMP-1的活性，TIMP-1可与MMP-1 酶原非催化位点结合，抑制酶原的活化。同时TIMP-1可与活化的MMP-1、MMP-3 形成复合物抑制两者的活性，还能以非共价键形式与明胶酶原结合，抑制明胶酶原自活化，与明胶酶原结合的TIMP-1 仍可抑制MMP-1的活性。研究发现肝组织内TIMP-1 水平与肝组织炎症和肝纤维化程度密切相关，在正常肝组织中既有表达，随着肝纤维化的发生、发展表达逐渐增强，而随着纤维的自然消散则迅速下降［8］。因此，研究抑制TIMP-1 继续活化的方法成为近年来治疗肝纤维化的突破点之一［9］。

HCV 是一个由脂膜包裹的正链RNA 病毒。根据所编码蛋白的结构和功能，其基因组分为结构基因(structural gene)和非结构基因(unstructural gene)。大量的研究表明HCV 核心蛋白具有广泛的反式调节作用，并参与肝纤维化的发生。那么HCV 核心蛋白对TIMPs的表达是否同样具有调节作用?是否HCV的核心蛋白通过对TIMPs 表达的影响而参与了肝纤维化向肝硬化的发展?这一假设的提出，要求我们从DNA水平或转录水平去研究HCV 核心蛋白对TIMPs 表达的影响。本研究采用脂质体转染技术将PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p 共同转染入人肝星状细胞系LX-2中，同时分别设立阴性对照组和阳性对照组。采用ELISA 法检测各个细胞组CAT 表达的差异，结果显示PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p 共同转染的细胞组，其CAT 表达明显高于同期单独转染pCAT3-TIMP-1p的细胞组，方差分析提示各组差异有统计学意义，LSD 法比较均显示两组之间差异有统计学意义，提示PcDNA3.1(－)-HCVcore 与pCAT3-TIMP-1p 共转染后，pCAT3-TIMP-1p的表达增加。因而得出结论，HCV 核心蛋白通过激活TIMP-1启动子的活性而上调TIMP-1的表达，进一步证实了HCV 引起肝纤维化和肝硬化的可能分子机制。从另一个角度阐明了经过积极抗病毒治疗的患者，他们的肝脏解剖结构可以改善、逆转的原因。

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