人参二醇皂甙对内毒素休克大鼠肾组织CD14和IL－18表达的影响

鄢春亭 陈奕名 韩 笑 (吉化集团公司总医院内分泌科，吉林 吉林 3202)

内毒素休克所致的肾功能障碍是临床常见的危重急症，其中70%的病人需要肾脏替代治疗，死亡率仍居高不下〔1〕。脂多糖内毒素(LPS)可通过激活一系列信号传导途径，刺激机体免疫细胞释放大量细胞因子及自由基，诱发炎症级联反应〔2〕。此过程中，肾脏是受累的重要器官，单核细胞(CD14)即LPS受体是通常选择的关键蛋白，在LPS信号转导过程中起重要作用。本实验拟探讨CD14与白细胞介素-18(IL-18)在内毒素休克大鼠肾组织中的变化以及人参二醇皂苷(PDS)对其影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 PDS(吉林大学天然药物研究室提供);大肠埃希杆菌内毒素(LPS，E.Coli 0111:B4)，购于 Sigma公司;CD14多克隆抗体(BA0719)，IL-18多克隆抗体(BA1215)购于博士德生物有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分组 30只成龄Wistar大鼠，吉林大学医学动物繁育中心提供。雌雄不拘，体重(250±10)g，随机分为空白对照组(CTR)，LPS模型组(LPS)，人参二醇皂苷预防治疗组(PDS)。

1.2.2 模型建立及组织留取 Wistar大鼠实验前禁食过夜，自由摄水。实验当天用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧固定于鼠板上。手术分离一侧股动脉并插管，与压力传感器相连，记录基础血压。舌下静脉注射 LPS(5 mg/kg)，平均血压下降至实验前基础血压的2/3时判定为休克状态，记录休克前后不同时间点动脉血压的动态变化。实验前CTR组和LPS组静脉注射5%葡萄糖溶液(5 ml/kg);PDS组用人参二醇皂苷(20 mg/kg)，均以等容量的5%葡萄糖配制静脉注射。10 min后除CTR组外，均经舌下静脉注射5%葡萄糖稀释的LPS(5 mg/kg)，CTR组静脉注射等容量的5%葡萄糖溶液。于休克240 min时处死动物。取肾脏置液氮中速冻，后转为－70℃保存，用于蛋白质的研究。另取肾脏组织置10%中性甲醛中固定16 h，石蜡包埋，切片，用于形态学研究。

1.2.3 肾脏组织免疫组织化学 应用链霉亲和素-生物素复合物(SABC)免疫组织化学染色法，常规方法处理玻片后用3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，正常兔血清滴于组织片上封闭非特异蛋白，加兔抗鼠CD14多克隆抗体(1∶500稀释浓缩型抗体)，后滴加生物素化的兔抗鼠IgG，显微镜下观察组织中CD14表达，照相。

1.2.4 CD14和IL-18蛋白表达

1.2.4.1 肾脏组织蛋白的提取 参照《分子克隆学》提供的方法提取肾组织总蛋白和膜蛋白，并以Bio-rad蛋白检测试剂盒测定提取蛋白的浓度。

1.2.4.2 Westren印迹 取蛋白15 μg，加蛋白上样缓冲液，加10%十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭过夜。分别以CD14，IL-18进行免疫印迹杂交(兔抗大鼠CD14多克隆一抗浓度为1∶500稀释，兔抗大鼠IL-18多克隆一抗浓度为1∶300稀释)，室温与膜孵育120 min，洗膜后加入1∶2 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗兔IgG二抗。室温孵育60 min。然后溶于过硫酸铵(AP)缓冲液的碱性磷酸酶底物显色试剂盒(NBT-BCIP)显色液显色。特异性条带的光密度值采用上海天能科技有限公司GIS图像分析系统处理。阴性对照膜用未免疫的兔血清1∶200稀释，代替一抗，其他过程同上。

2 结果

2.1 肾脏组织CD14免疫组化结果 LPS组的肾脏组织CD14蛋白呈阳性表达，而PDS组CD14蛋白表达水平与LPS组相比明显降低。见图1。

2.2 肾脏组织CD14的表达 Westem印迹扫描分析肾脏组织LPS组的肾脏组织CD14蛋白表达水平最高，而PDS组CD14蛋白表达水平与LPS组相比明显降低。见图2，表1。

图1 CD14在内毒素休克大鼠肾脏的表达(×40)

表1 各组肾脏组织中CD14和IL-18蛋白相对含量(±s，n=3)

表1 各组肾脏组织中CD14和IL-18蛋白相对含量(±s，n=3)

与CTP组比较:1)P＜0.05;与LPS组比较:2)P＜0.05

组别 CD14蛋白 IL-18蛋白CTR组0.280 5±0.003 7 0.207 7±0.006 2 LPS组 0.924 1±0.028 01) 4.142 4±0.051 81)PDS组 0.620 7±0.004 42) 1.319 0±0.010 92)

图2 Western印迹分析各组肾脏中CD14的表达

2.3 肾脏组织IL-18蛋白的表达 Westem印迹扫描分析肾脏组织，与CTR组相比，LPS组IL-18蛋白表达水平明显增高;与LPS组相比，PDS组IL-18蛋白表达水平明显减少。见表1，图3。

图3 Western印迹分析各组肾脏中IL-18的表达

3 讨论

内毒素休克以全身性低血压和多脏器衰竭为主要临床特征，导致的肾功能障碍是临床常见的危重急症。全身炎症反应综合征是引起多器官功能障碍的重要原因，而炎细胞的持续活化与播散，活化炎细胞产生炎性介质的失去自限性，通过自我无限放大的级联反应，炎症介质过多产生与释放，引起细胞乃至脏器损伤，严重者导致多脏器衰竭，成为内毒素休克死亡的重要原因。目前研究已经证明，LPS受体介导的信号转导通路被激活是导致炎症细胞活化及促炎因子大量释放的关键。LPS首先与LPS的结合蛋白(LBP)结合，再传递给膜受体CD14，形成LPS-LBP-CD14复合物〔3〕，该复合物与跨膜受体TLR-MD2相互作用，通过激活细胞内的信号传导通路而最终导致核转录因子(NF-κB)活化入核，引起多种炎症因子(TNF-α，IL-6，IL-18等)的合成与释放〔4～6〕。

肾小球系膜细胞(MCs)是肾小球内非常活跃的固有细胞，在内毒素休克肾脏损伤中既是靶细胞，又是参与者。肾小管上皮细胞(TECs)是肾脏的另一重要细胞，具有抗原递呈功能，并可通过自分泌和旁分泌方式分泌多种炎症因子参与肾小管的炎症形成〔7〕。研究表明，MCs表面可表达膜 CD14分子(mCD14)。mCD14在人类和多种动物的单核细胞上大量表达，粒细胞上少量表达，在多数组织巨噬细胞也有表达，它们统称为CD14阳性细胞。典型的CD14阳性细胞对LPS的反应模式为:LPS先与LBP形成复合物，再与mCD14结合，然后引起细胞内信号转导及细胞效应的产生〔8，9〕。而 TECs不能表达mCD14，可由LPS直接刺激，与sCD14结合，产生活性氧自由基及炎症细胞因子。

本实验结果显示，LPS组大鼠肾脏组织CD14，IL-18蛋白表达明显高于对照组，而PDS组能显著降低其表达。由此可见，PDS可阻断LPS与受体结合向细胞内转导信号，从而在LPS信号传导通路的上游发挥作用，避免了继续的过度反应，减少了NF-κB的入核，使各种炎症因子的表达量减少。

PDS为人参总甙中水溶性部分，是人参重要活性成分，有广泛的药理作用。本研究室对PDS从事多年研究表明，PDS具有降血脂、抗血小板聚积、抗心肌缺血、提高身体免疫力、预防感染等作用，PDS对内毒素休克大鼠肝脏及肺脏有明显的保护作用〔10，11〕。本研究结果表明:PDS抑制CD14的表达，从而抑制IL-18等炎症因子的释放，是实现对肾脏保护作用的重要机制。

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