冬凌草甲素诱导人胰腺癌SW1900细胞 DNA损伤及对H2AX蛋白表达的影响

罗 兰 侯 杰 邱 冰 曹惠君 魏凤香

(佳木斯大学附属第一医院消化一科，黑龙江 佳木斯 154002)

冬凌草甲素(ORI)是从唇形科香茶菜属〔Rabdosia(Bl.)Hassk.〕植物中分得的一种贝壳杉烯二萜类化合物。冬凌草中主要抗癌活性成分是 ORI，其味道极苦〔1，2〕，具有清热解毒、消炎止痛、抗肿瘤之功效，用于治疗扁桃体炎、咽喉肿痛，对多种癌症有缓解症状和延长生存时间的作用，也可作为增强放化疗疗效的辅药〔3〕。研究表明，ORI对20余种人癌细胞株生长均有明显的直接抑制作用〔4〕。前期工作表明 ORI对人胰腺癌SW1900细胞具有生长抑制和诱导凋亡作用，同时抗凋亡蛋白Bcl2-2表达的降低和促凋亡蛋白Bax上调是ORI体外诱导胰腺癌SW1900细胞发生凋亡的重要作用机制之一〔5〕。磷酸化的组蛋白(H2AX)可以作为DNA损伤早期检测的金标准。本课题组观察不同浓度的ORI注射剂诱导胰腺癌SW1900细胞的DNA损伤作用，并探讨H2AX蛋白的表达情况。

1 材料与方法

1.1 材料 ORI由中国科学院昆明植物研究所提供，用DMSO溶解(浓度≤0.1%)DMEM培养基;小牛血清(美国Gibco公司);H2AX(1∶100)，γ-H2AX(1∶100)，Phos-S1981ATM γ-H2AX(1∶100，Cell Signalling，辣根过氧化酶标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶1 000，Santa Cruz Biltechnology公司);β-actin(美国Santa Cruz公司)。低熔点琼脂糖(德国Merck-Darmstadt公司)。EB(PI，美国 Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 人胰腺癌SW1990细胞株购自武汉大学中国典型培养物保藏中心。细胞接种于含10%小牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，常规消化传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 彗星试验 参照Hockemeyer等〔6〕的方法改良。不同浓度的 ORI(20，40，80 μmol/L)处理 SW1900 细胞 48 h 后，收集2×106/ml细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次。制备0.5%的正常熔点琼脂糖和0.5%的低熔点琼脂糖。取细胞悬液与0.5%低熔点琼脂糖混匀后加到预处理过的磨砂玻片上经细胞裂解和DNA解旋后于4℃、25 V、300 mA条件下电泳25 min;经过中和、苏木素-伊红(EB)染色、低温避光，最后在荧光显微镜下计数拖尾细胞百分数(彗星率)并测量拖尾细胞尾长。每个样本随机测量100个彗星细胞的尾长和300个细胞中彗星样细胞的数目。

1.2.3 Western印迹检测H2AX蛋白表达 不同浓度的ORI(20，40，80，160 μmol/L)处理 SW1900 细胞 48 h 后，收集 2 ×106/ml细胞，用预冷的PBS洗2次，在4℃裂解30 min，离心15 min，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。然后进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶分离，再进行免疫印迹，将蛋白转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，浸没于封闭液(含1%BSA的TBS)中摇荡1 h.封闭后，进行一抗孵育，将一抗按照推荐浓度溶于封闭液中，与对应膜共同封闭在塑料袋中，4℃下过夜。一抗孵育结束后，用TBST(TBS+0.1%Tween20)漂洗膜4次，每次15 min，再使用对应的二抗孵育，按照相应比例稀释(1∶1 000～1∶10 000)，室温轻摇 1 h，二抗孵育结束后，再用TBST漂洗膜4次，每次15 min，最后使用辣根过氧化物酶发光显色法(HRP-ECL)对膜进行显色曝光。

1.2.4 免疫荧光检测γ-H2AX焦点 调整细胞浓度至1×105/ml，按每孔2 ml的体积，接种细胞于6孔板中，设对照组和不同浓度的 ORI(20，40，80 μmol/L)处理 SW1900 细胞 48 h后，处理结束，4%多聚甲醛冰上固定，一抗室温孵育2 h，加入荧光二抗37℃孵育1 h，4’6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)室温孵育15 min。激光共聚焦扫描显微镜观察计数、采集图像，每组实验重复3次，每张玻片至少计数50个细胞。

1.3 统计学方法 应用SPSS10.0统计软件，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析及直线相关回归分析。

2 结果

2.1 彗星实验结果 见表1。与空白对照组相比，不同浓度ORI处理的细胞彗尾长度及彗星率增加(P＜0.01)，并随着质量浓度的增加，细胞彗尾长度及彗星率增加，呈现一定的剂量-效应关系(P＜0.01)。

表1 各组彗尾长度与彗星率比较(±s，n=9)

表1 各组彗尾长度与彗星率比较(±s，n=9)

与空白对照组比较:1)P＜0.05

组别 彗尾长度 彗星率(%)空白对照组5.55±0.8 7.03±1.1 ORI组 20 μmol/L 19.96 ±4.81) 25.49 ±1.61)40 μmol/L 33.14 ±4.91) 51.12 ±1.11)80 μmol/L 43.12 ±4.651) 95.49 ±4.91)

2.2 ORI对SW1900细胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点形成的影响 对照组几乎没有Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点形成，各实验组Phos-S1981ATM和γ-H2AX的焦点数明显增加。随ORI浓度的增加，SW1900细胞平均焦点数和焦点细胞率呈逐渐增加趋势(P＜0.05)。见图1。

2.3 Western印迹结果 不同浓度的 ORI(DMSO，20，40，80 μmol/L)处理SW1900细胞48 h后结果表明，随着浓度的增加，γ-H2AX蛋白水平呈逐渐增加趋势(P＜0.05)。见图2。

图2 冬凌草甲素对SW1900细胞Phos-S1981ATM和γ-H2AX焦点的影响(×1 000)

图2 Western印迹结果

3 讨论

H2AX是一类进化上保守的组蛋白H2A的变体〔7〕。DSB的早期生物效应标志之一，就是组蛋白H2AX的快速和大量磷酸化，即形成γ-H2AX，γ-H2AX招募修复蛋白并在DSB周围形成焦点，一个γ-H2AX焦点就代表着一处DSB，γ-H2AX的焦点数越多，表明细胞内的DSB越多，γ-H2AX已成为检测DSB的“金标准”〔8，9〕。因此，本研究选择 γ-H2AX作为检测指标，分析了ORI对体外胰腺癌细胞DNA的损伤。

与其他一些常见的恶性肿瘤相比，胰腺癌的治疗效果较差。外科手术仍然是最有可能为胰腺癌带来治愈希望的治疗手段，但是综合治疗必不可少。本研究免疫荧光和Western印迹结果表明，ORI作用浓度越高，细胞发生DSB的部位越多，这与ORI的抗肿瘤机制相佐证。彗星实验结果还显示，当ORI作用浓度增加，DNA损伤程度也增加，免疫荧光结果与彗星实验结果相一致。DNA损伤反应是细胞应对基因毒压力所产生的反应，包括DNA修复、细胞周期阻滞、细胞凋亡等，真核生物细胞的遗传物质能够正确复制并被精确传到下一代，主要是由于细胞拥有一套有效的DNA损伤反应机制。共济失调-毛细血管扩张突变基因(ATM)和Rad-3相关蛋白(ATR)激酶可以感知DNA损伤，并将DNA损伤信号传导到下游靶蛋白，启动应激系统，产生细胞周期阻滞，从而完成DNA修复或启动细胞凋亡程序〔10～12〕，因此ATM和ATR对维持细胞基因组的稳定和防止肿瘤的发生至关重要。

1 张典瑞，任天池.冬凌草甲素的药学研究进展〔J〕.中国药学杂志，2003;38(11):817-20.

2 刘家云，魏 敏，顾琴龙.冬凌草甲素抗肿瘤的研究进展〔J〕.中国新药与临床杂志，2010;29(2):81-4.

3 刘 净，梁敬钰，谢 韬.冬凌草研究进展〔J〕.海峡药学，2004;16(2):1-7.

4 Chen J，Wang S，Chen D，et al.The inhibitory effect of oridonin on the growth of fifteen human cancer cell lines〔J〕.Am J Clin Oncol，2007;4(1):16-20.

5 魏凤香，李美玉，李红枝，等.冬凌草甲素对胰腺癌SW1900细胞凋亡的影响〔J〕.南方医科大学学报，2009;29(8):1714-5.

6 Hockemeyer D，Sfeir AJ，Shay JW，et al.POT1 protects telomeres from a transient DNA damage response and determines how human chromosomes end〔J〕.EMBO J，2005;24(14):2667-78.

7 Redon C，Pilch D，Rogakou E，et al.Histone H2A variants H2AX and H2AZ〔J〕.Curr Opin Genet Dev，2002;12(2):162-9.

8 Kinner A，Wu W，Staudt C，et al.Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strain breaks in the context of chromatin〔J〕.Nucleic Acids Res，2008;36(17):5678-94.

9 Paull TT，Rogakou EP，Yamazaki V，et al.A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage〔J〕.Curr Biol，2000;10(15):886-95.

10 Lee JH，Paull TT.ATM activation by DNA double-strand breaks through the Mre11-Rad50-Nbs1 complex〔J〕.Science，2005;308(5721):551-4.

11 Falck J，Coates J，Jackson SP.Conserved modes of recruitment of ATM，ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage〔J〕.Nature，2005;434(7033):605-6.

12 Jazayeri A，Falck J，Lukas C，et al.ATM and cell cycle-dependent regulation of ATR in response to DNA double-strain breaks〔J〕.Nat Cell Bio，l 2008;8(1):37-45.