白芍总苷联合吡美莫司治疗散发型白癜风的临床疗效及相关实验研究

叶蓉，聂李平，胡小平，黄星涛，江晓君

（北京大学深圳医院，深圳518036）

白癜风是一种病因不明的色素脱失性皮肤病，自身免疫学说越来越受到关注。CD4+CD25+调节性T细胞（T regulatory cells，Treg）水平或功能降低可能在白癜风发病中发挥重要作用[1-2]，CD4+/CD8+T细胞比值的变化可反应机体免疫失调情况。我们应用白芍总苷胶囊（total glucosides of paeony，TGP）联合吡美莫司软膏（pimecrolimus）治疗散发型白癜风患者，通过观察治疗前后患者皮损恢复情况，并检测外周血中CD4+/CD8+T细胞比值和CD4+CD25+Treg水平的变化来评价其治疗效果，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 45例散发型白癜风患者来自于我院皮肤科2010年5月—2012年10月门诊患者，其中男21例，女24例，年龄18～64岁，平均34.97岁。依据病程长短分为3组，各组皮损面积差异无统计学意义。诊断标准符合中国中西医结合学会皮肤性病专业委员会色素病学组修定的《白癜风临床分型及疗效标准》。所有患者均排除其他自身免疫性疾病、肿瘤及严重心肝肾等器质性疾病，女性排除妊娠及哺乳期者，检测前1个月内未接受任何治疗，所有患者均签署相关知情同意书。治疗中如发生不可耐受的不良反应等情况，则终止临床试验，该病例不纳入统计分析。

1.2 实验药物 1%吡美莫司软膏（爱宁达）购自德国PharmaNovartis公司，国药准字H20050485，规格15 g/（支·盒）；白芍总苷胶囊（帕夫林）购自宁波立华制药有限公司，国药准字H20055058，规格0.3g/粒，36 粒/盒。

1.3 主要试剂和仪器 异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记抗人CD4抗体、藻红蛋白（phycoerythrin,PE）标记抗人CD25抗体、FITC标记小鼠免疫球蛋白G（immunoglobulin G,IgG）同型对照及PE标记小鼠IgG同型对照的抗体购自美国BioLegnd公司，Simultest IMK Lymphocyte试剂盒购自美国BD公司，红细胞裂解液购自上海瑞齐生物技术有限公司，流式细胞仪购自美国BeckMAN公司。

1.4 临床疗效判定 45例散发型白癜风患者，均给予白芍总苷胶囊1.2～1.8 g/d联合1%吡美莫司软膏外用，3个月后评价皮损恢复情况。痊愈：白斑全部消退，恢复正常肤色；显效：白斑部分消退或缩小，恢复正常肤色的面积占皮损面积≥50%；好转：白斑部分消退或缩小；无效：白斑无色素再生或扩大。有效率用痊愈和显效例数占总例数的百分比表示。

1.5 标本采集及检测 采集治疗前后患者肘正中静脉血5 mL，放入肝素化试管中，倒转摇匀，6 h内检测。小心吸取抗凝全血100 μL，分别加抗CD3-FITC、抗 CD4-PE 抗体各 10 μL，充分混匀，室温避光孵育20 min，加入红细胞裂解液2 mL，充分混匀，室温避光孵育10 min，至液体透亮，1000 r/min离心5 min，弃上清。加入PBS液2 mL，1000 r/min离心5 min，弃上清，洗涤2次。将细胞悬浮于0.5 mL磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline,PBS）洗涤液中，振荡混匀后上流式细胞仪检测CD3+CD4+T细胞。同理用抗CD3-FITC、抗CD8-PE抗体测定CD3+CD8+T细胞，用抗CD4-FITC、抗CD25-PE抗体测定CD4+CD25+Treg。利用功能软件得到CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+Treg细胞水平分析。

1.6 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据分析，数据用均数±标准差表示，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验，显著性水平α＝0.05。

2 结果

2.1 3组散发型白癜风患者皮损恢复情况 临床疗效见表1。45例中白芍总苷胶囊剂量第1周均为1.8 g/d，分3次口服，其中12例出现大便次数明显增多，第2周剂量减为1.2 g/d，分2次口服，耐受后有4例患者于第3～4周起剂量恢复为1.8 g/d，余8例维持1.2 g/d。另有4例外用吡美莫司软膏局部出现红斑，轻度刺痛，坚持治疗1～2周后耐受。

表1 白芍总苷联合吡美莫司治疗散发型白癜风的临床疗效对比 例

2.2 3组散发型白癜风患者外周血T细胞变化情况 治疗后3组散发型白癜风患者外周血CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+Treg水平均分别高于各组治疗前，且差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。病程＜6个月组患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值及CD4+CD25+Treg水平升高程度较另2组明显，且差异有统计学意义，而病程6个月～2年组比≥2年组升高明显，但差异无统计学意义（P＞0.05，见表 3）。

表2 治疗前后患者外周血T细胞变化情况

表3 白芍总苷联合吡美莫司对患者CD4+/CD8+T细胞比值的影响

3 讨论

目前白癜风治疗效果欠佳，皮损易复发，需长期反复治疗，因此寻找安全而有效的治疗方法，一直是白癜风研究的热点。CD4+CD25+Treg是一群具有免疫抑制及免疫无能作用的T细胞亚群，对维持机体免疫自稳和免疫耐受有重要作用，其数量的缺乏或功能的缺陷与多种人类自身免疫性疾病的发生密切相关[3]。Th17能够诱导某些自身免疫病的发生，而CD4+CD25+Treg则发挥着保护作用[4-5]。Sujino等[6]研究表明，CD4+CD25+Treg能够抑制Th17向Th1细胞的转化，延缓结肠炎的进展。众多研究表明，白癜风患者体内存在CD4+/CD8+T细胞比值和CD4+CD25+Treg水平的下降[7]。

白芍总苷胶囊已广泛用于干燥综合征、系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病的治疗，并取得较好的疗效[8-9]。Zhao等[10]研究发现，白芍总苷可能通过诱导Treg细胞的分化，从而调节Foxp3启动子的甲基化状态，并激活IFN-γ和IL-2信号通路，最终抑制系统性红斑狼疮患者体内的自身免疫反应。白芍总苷治疗白癜风效果如何，仍未见报道。

临床观察显示，白芍总苷联合吡美莫司软膏能促进散发型白癜风患者皮损的恢复，病程越短临床效果越明显。本实验还发现，白芍总苷能够一定程度提高患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值和CD4+CD25+Treg水平，这两者在维持机体免疫自稳中发挥着重要作用，可能是导致患者皮损恢复的机制之一，同时对降低白癜风的皮损复发也可能起着一定作用。结果提示这种作用与病程有关，病程＜6个月者效果明显优于病程≥6个月者。由于白芍总苷具有养血柔肝等作用，可为合并肝功能不全患者提供新的选择。

综上所述，白芍总苷可能通过升高白癜风患者外周血中CD4+/CD8+T细胞比值和CD4+CD25+Treg水平，从而提高患者对维持机体免疫自稳和免疫耐受的能力，进而促进皮损的愈合，且这种作用随着病程的增加而减弱。但白芍总苷是如何调节T淋巴细胞的具体作用机制仍不清楚，可能通过诱导Treg细胞的分化而实现这种调节[10]，又可能通过何方式与黑素细胞相互作用等问题，仍有待进一步的探讨。

[1] 王小霞,余春艳,张英起,等.银屑病和白癜风患者外周血CD4+CD25+调节性T细胞的检测[J].中国麻风皮肤病杂志,2009,25:576-578.

[2] 白明辉,王竞,涂彩霞,等.白癜风患者外周血CD4+CD25+调节T细胞的检测[J].中华皮肤科杂志,2009,42:460-462.

[3] Jiang S，Lechler RI.CD4+CD25+regulatory T-cell therapy for allergy,autoimmune disease and transplant rejection[J].Inflamm Allergy Drug Targets,2006,5:239-242.

[4] Hamzaoui K.Th17 cells in Beh觭et’s disease:a new immunoregulatory axis[J].Clin Exp Rheumatol,2011,29:S71-S76.

[5] Jadidi-Ninragh F,Mirshafiey A.The deviated balance between regulatory T cell and Th17 in autoimmunity[J].Immunopharmacol Immunotoxicol,2012,34:727-739.

[6] Sujino T,Kanai T,Ono Y,et al.Regulatory T cells suppress development of colitis,blocking differentiation of T-helper 17 into alternative T-helper 1 cells[J].Gastroenterology,2011,141:1014-1023.

[7] Gunduz K,Ozturk G,Terzioglu E,et al.T cell subpopulations and IL-2R in vitiligo[J].Dermatol,2004,31:94-97.

[8] Zhang HF,Hou P,Xiao WG.Clinical observation on effect of total glucosides of paeony in treating patients with non-systemic involved Sj觟grensyndrome[J].ZhongguoZhongXiYiJieHeZaZhi,2007,27:596-598.

[9] Zhang HF,Xiao WG,Hou P.Clinical study of total glucosides of paeony in patients with systemic lupus erythematosus[J].Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi,2011,31:476-479.

[10]Zhao M,Liang GP,Tang MN,et al.Total glucosides of paeony induces regulatory CD4（＋）CD25（＋）T cells by increasing Foxp3 demethylation in lupus CD4（＋）T cells[J].Clin Immunol,2012,143:180-187.