激光共聚焦显微镜和免疫组化染色对比观察KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹的表达

吴振恭，褚汉启，熊俊，陈金川，刘云，陈金，周良强，熊浩

激光共聚焦显微镜和免疫组化染色对比观察KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹的表达

吴振恭1*，褚汉启2*，熊俊1，陈金川1，刘云2，陈金2，周良强2，熊浩3

目的：采用激光共聚焦显微镜（LSCM）技术和免疫组化染色检测KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹中的表达分布特征。方法：以KCNQ1－/－突变纯合子基因型小鼠和CBA/CaJ小鼠为实验对象，采用免疫组化染色、LSCM结合免疫学标记方法对比观察血管纹KCNQ1蛋白表达情况。结果：免疫组化染色显示CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞顶膜KCNQ1蛋白高表达，呈棕褐色；LSCM观察显示免疫单标KCNQ1绿色荧光蛋白分布于CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞细胞核，KCNQ1－/－小鼠边缘细胞均未见阳性反应。结论：LSCM技术能准确显示KCNQ1在小鼠耳蜗血管纹中表达及细胞定位。

KCNQ1；基因敲除小鼠；边缘细胞；激光共聚焦显微镜

血管纹位于耳蜗外侧壁，血供丰富，是构成蜗管外壁的重要部分，由边缘细胞、中间细胞、基底细胞三层构成。目前认为，血管纹中最主要的功能细胞是边缘细胞，其主要功能是通过底侧膜上的Na+-K+-ATP酶及NKCC1将血管纹内间隙的K+转运到边缘细胞细胞浆内，从而降低血管纹内间隙中的K+浓度[1,2]。边缘细胞内的K+通过边缘细胞顶膜的KCNQ1/KCNE1 K+通道，被动流入内淋巴[3,4]，从而完成K+向内淋巴的扩散，并维持内淋巴的高K+状态[5,6]。缺乏KCNQl则导致K+在边缘细胞基底侧膜至内淋巴处分泌障碍，由于进入内淋巴的K+不足，主要由K+构成的耳蜗内电位下降甚至消失，导致在声音的机械-电转导过程中K+进入毛细胞的驱动力下降，毛细胞去极化的程度降低，从而影响神经递质释放，最终造成听力损失。因此，了解边缘细胞K+通道分布特点，对于全面理解血管纹参与耳蜗K+转运和K+循环机制具有十分重要的意义。目前，激光共聚焦扫描显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）技术不断发展，其成像分辨率大大提高，且对荧光探针标记细胞组织切片可进行连续断层扫描，无损伤，且精确、可靠。为此，本研究拟采用LSCM和免疫组化染色对比观察边缘细胞KCNQ1蛋白的分布特点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 KCNQ1基因敲除小鼠购自美国Jackon实验室，由亲代KCNQ1＋/－杂合子小鼠雌雄配对自行培育出第二代小鼠，按照孟德尔遗传法则在华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心进行培养繁殖，并基因鉴定出KCNQ1－/－小鼠为实验对象。CBA/CaJ小鼠购置于上海实验动物中心，按SPF级标准饲养。

1.1.2 主要试剂与仪器 羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗体，购于美国Santa Cruz公司；兔抗羊IgG抗体，购于北京中山生物技术有限公司；Fluoview FV500型LSCM购于日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 耳蜗切片标本制备 取4周龄小鼠，断颈快速处死，取出听泡，在解剖显微镜下去除镫骨，打开前庭窗和圆窗，蜗尖钻孔，4%多聚甲醛固定液灌流固定，并重固定于该固定液中24 h（4℃），固定后耳蜗经0.01 mmol/L磷酸盐缓冲液（phosphatic buffered saline，PBS）洗涤，然后用 10% EDTA脱钙1周，每天更换脱钙液1次，后移入30%蔗糖溶液沉淀过夜。采用日本SAKURA包埋剂包埋固定，沿蜗轴方向行冰冻连续切片，厚度约8～10 μm。

1.2.2 KCNQ1免疫组化染色（两步法） 参照过氧化物酶标记的链霉卵白素染色法（streptavidin-peroxidase，SP）试剂盒说明书进行染色。操作步骤：耳蜗冰冻切片3%过氧化氢去底物；5%正常羊血清封闭；加入一抗羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗体（1∶200）4℃湿盒过夜；加入二抗生物素化标记的兔抗羊IgG抗体37℃温育60 min；辣根过氧化物酶标记链霉卵白素37℃孵育30 min；3'3-二氨基苯联胺（diaminobenzidine，DAB）显色；苏木素复染；二甲苯透明；封片。以上步骤之间均用0.01 mmol/L PBS漂洗3遍，每次5 min。用PBS代替一抗为阴性对照。在光学显微镜下观察并照相，阳性为细胞内有棕色的反应产物。

1.2.3 LSCM技术成像 将冰冻切片进行KCNQ1免疫单标染色。切片常规室温放置30 min后4℃丙酮固定，3%H2O2灭活内源性过氧化物酶30 min，10%正常羊血清阻断非特异性结合部位30 min，倒去血清，每例标本滴加1∶200羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗体，孵育、振洗，加入FITC标记的兔抗羊IgG（1∶100），孵育、振洗，甘油封片，LSCM下观察。

2 结果

2.1 免疫组化染色

KCNQ1蛋白阳性表达于血管纹边缘细胞，呈棕褐色。KCNQ1－/－小鼠未见明显阳性变化，CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞顶膜阳性表达显著，见图1。

图1 KCNQ1－/－小鼠（A）和）CBA/CaJ小鼠（B）血管纹边缘细胞KCNQ1蛋白表达（SP染色，×200）

2.2 LSCM观察

KCNQ1蛋白阳性反应细胞呈绿色荧光标记。KCNQ1－/－小鼠边缘细胞未见绿色荧光阳性变化，CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞核可见阳性高信号表达，见图2。

图2 LSCM观察KCNQ1－/－小鼠（A）和）CBA/CaJ小鼠（B）血管纹边缘细胞KCNQ1蛋白表达（FITC染色，×40）

3 讨论

免疫组化染色作为一种定性研究，很难对实验对象的空间分布进行全面分析。本研究免疫组化染色结果显示，CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞顶膜呈棕褐色样阳性表达，但无法进行更准确的细胞定位。同时，本研究应用FITC免疫荧光单标记KCNQ1，以LSCM观察发现CBA/CaJ小鼠血管纹边缘细胞核可见高荧光强度表达，与免疫组化相比，LSCM更直观、准确。LSCM是在荧光显微镜成像基础上加装激光扫描装置，利用共聚焦成像的原理及激光波长狭窄的优点，使其成像清晰，分辨率较普通显微镜提高30%～40%，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察细胞形态。

KCNQ1蛋白是一种电导很小的K+通道，广泛分布于上皮与非上皮组织。依照目前的耳蜗钾循环理论，KCNQ1在耳蜗K+循环及在维持耳蜗内电位中起重要作用[7,8]。笔者课题组成员前期研究利用C57BL/6J小鼠耳蜗进行免疫组化染色显示，KCNQ1蛋白集中表达于血管纹的边缘细胞顶膜，在耳蜗其他组织染色很弱[9]。李建玲等[10]采用倒置荧光显微镜进行对KCNQ1和NKCC1蛋白进行研究表明，KCNQ1蛋白主要呈带状分布于耳蜗血管纹边缘细胞顶膜处。本研究证实KCNQ1蛋白存在于血管纹的边缘细胞。

本研究中，免疫组化染色和LSCM分别显示KCNQ1蛋白表达于血管纹的边缘细胞顶膜或细胞核，两者细胞具体定位有一定差异。国外有学者发现血管纹边缘细胞顶膜上有KCNQ1蛋白的表达，同时发现前庭暗细胞和血管纹边缘细胞有Isk表达[11,12]。这种定位差异，笔者认为可能跟荧光染色二抗是羊抗小鼠KCNQ1多克隆抗体，出现交叉反应，造成假阳性有关，有必要进一步实验证实。

应用免疫组化染色与LSCM观察相比有不同优缺点：首先，免疫组化染色是应用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究，但不能精确定量，而且有时会有假阳性，不易与背景区分；LSCM是利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察分析对象进行数字图象处理的一套观察和分析系统。LSCM要求进行荧光染色，需要考虑荧光染色的灰度混迹、荧光信号的损失、实验试剂增加费用等方面。

本研究应用LSCM技术证实KCNQ1蛋白免疫荧光标记的阳性产物主要定位于边缘细胞上，与免疫组化染色相比，LSCM观察更直观。

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Expression and Subcellular Localization of KCNQ1 in Stria Vascularis of Mice Cochlea by Laser Scanning Confocal Microscopy and Immunohistochemistry Staining

Objective:To investigate the expression and distribution of KCNQ1 in stria vascularis of murine cochlea with laser scanning confocal microscopy (LSCM)and immunohistochemistry staining technique. Methods:With LSCM and immunohistochemistry staining,the location of KCNQ1 in cochlea of the CBA/CaJ and KCNQ1－/－mice were observed.Results:Immunohistochemical staining showed that the expression of KCNQ1 protein was found at the apical membrane wall of marginal cells in stria vascularis of CBA/CaJ mice. There was no KCNQ1 protein expression in marginal cells of KCNQ1－/－mice.The fluorescence of KCNQl protein was mainly expressed in the cell membrane of marginal cells of CBA/CaJ mice with LSCM.Conclusion: The expression and distribution of KCNQ1 protein in marginal cells of stria vascularis could be observed with LSCM.

KCNQ1;gene knockout mice;marginal cell;lascer scanning confocal microscopy

R741;R764

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.002

1.安溪县医院五官科福建 安溪 362400 2.华中科技大学同济医学院附属同济医院耳鼻咽喉-头颈外科武汉 430030 3.广州中山大学孙逸仙纪念医院耳鼻咽喉-头颈外科广州 510120注：*为并列第一作者

国家自然科学基金（No.81271078）福建省泉州市卫生局科研课题

2014-01-03

褚汉启qi7chu@163.com