机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的实验研究

陈佳，梁燕玲，郑璿，陈智毅，刘宇明，李斯颖

机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的实验研究

陈佳a，梁燕玲a，郑璿a，陈智毅b，刘宇明a，李斯颖a

目的：探讨机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的最佳参数。方法：机械振荡法制备激肽原酶载药微泡，利用不同的振荡时间，激肽原酶与微泡不同的混合比例，检测载药微泡的携带率、激肽原酶的效价、载药微泡的粒径及粒径分布、浓度、pH值、包封率。结果：振荡时间在45 s，载药微泡携带率最高，为（93.46± 1.7）%。激肽原酶与微泡混合比在4∶1的条件下，激肽原酶效价最高且达到合格标准。载药微泡的表面电位为（－56.47±8.23）mV，平均粒径为（13.2±7.3）μm，粒径范围为6～20 μm，浓度为（6～7）×108/mL，pH值为（6.20±0.01），包封率为（52.5±0.8）%。结论：采用机械振荡法可成功制备激肽原酶载药微泡，该载药微泡药物携带率高，稳定性较好，且能维持良好的药物效价。

激肽原酶；微泡；机械振荡

急性缺血性脑卒中占全部脑卒中的60%～80%[1]。超声介导微泡造影剂携带药物靶向治疗技术具有高效、靶向性强的优点[2]，可降低治疗成本和副作用，且不影响药物的活性。若能把该技术应用于急性脑梗死的治疗，应该具有广阔的前景。人尿激肽原酶（urinary kallikrein,UK）可通过建立侧枝循环、促进神经修复的双重机制来提高急性脑梗死后脑的储备能力。现有证据表明，人UK注射能减少急性缺血性脑卒中后神经功能缺损，改善长期预后[3]。本研究探索机械振荡法制备激肽原酶载药微泡的最佳参数，为超声介导微泡造影剂携带药物靶向治疗技术应用于急性脑梗死的临床治疗打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂：注射用六氟化硫（SF6）微泡（声诺维，购于瑞士Bracco Suisse SA公司）；注射用尤瑞克林（产品批号311112011，购于广东天普生化医药股份有限公司），主要成分为人 UK；异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的UK—FITC-UK（由吉尔生化上海有限公司合成）；底物S-2266 （H-D-Val-Leu-Arg-PNA·2HCl，25 mg，MW579.6，购于意大利Chromogenix公司）。仪器：FACS Calibur流式细胞仪（购于美国BD公司）；ST-B型胶囊式银汞调和器（购于北京安泰生物医用材料有限公司）；荧光显微镜（购于德国Leica Dmirb公司）；UVMINI-1240紫外分光光度仪、LC-20A反向高效液相色谱仪（购于日本岛津公司）；激光粒度测量仪（购于荷兰Ankersmid公司）；表面电位测量仪（购于英国Malvern公司）；细胞计数仪（购于美国Beckman Coulter公司）；pH计（购于瑞士Mettler Toledo公司）。

1.2 方法

1.2.1 UK载药微泡的制备 一支注射用SF6微泡用5 mL生理盐水溶解，用力振摇20 s直至瓶中内容物混合均匀，成乳白色混悬液，其浓度为每毫升微泡混悬液含SF68 μL（45 μg）。一支UK（0.15 PNA单位）用20 mL生理盐水溶解。根据微泡与UK混合的体积比，分为4组，分别为（2∶1）组、（1∶1）组、（1∶2）组、（1∶4）组，各组分别按比例取适量分装于西林瓶中避光密封保存备用。机械振荡仪系胶囊式调和器改装而成，水平往复式振荡，工作频率≥4 500次/min，振动幅度为（15±1）mm[4]。把UK和脂质微泡混合液置于机械振荡仪，分别振荡15、30、45、60、90 s。振荡完成后，分别取微量混合液滴于载玻片上，抗荧光淬灭剂封片。

1.2.2 吸光度检测 检测A405nm值并计算载药微泡中UK的效价，由广东天普生化医药股份有限公司质量控制部协助完成。试剂配制：0.2 mol/L三羟甲氨基甲烷缓冲液（pH8.0）（三羟甲基氨基甲烷24.2 g，加纯化水800 mL溶解，用6 mol/L盐酸调pH至8.0，再加纯化水至1 000 mL，混匀即得）；供试品溶液（取本品适量，加0.2 mol/L三羟甲氨基甲烷缓冲液（pH8.0）制成0.03 PNA单位/mL的溶液）；底物溶液（取S-2266一支，加入14.4 mL纯化水，制成0.003 mol/L贮存液，－20℃冻存，1年内使用。临用时，用纯化水稀释至0.001 5 mol/L使用）；50%醋酸溶液（量取 50 mL醋酸，加纯化水至100 mL，混匀即得）。检测取3支供试品管，平行操作，步骤如下：空白管和供试品管分别加入0.2 mL供试品溶液和4.0 mL的0.2 mol/L三羟甲氨基甲烷缓冲液（pH8.0），置（37±0.5）℃水浴5 min后，空白管加入50%醋酸溶液0.4 mL，供试品管加入底物溶液0.4 mL，立即混匀，置（37±0.5）℃水浴15 min后空白管加入底物溶液0.4 mL。以空白管调零，测定样品A405nm值。计算效价：PNA单位/mL＝173.6×A405nm×T/1000，173.6为反应常数，T为稀释倍数，1000为L与mL换算值。PNA单位/mL值在90%～115%之间为合格。

1.2.3 载药微泡的表征 在普通光镜下观察微泡的形态、大小；荧光显微镜下观察微泡的荧光标记情况；流式细胞仪分析UK的携带率及稳定性[5]；马尔文表面电位测量仪检测微泡的表面电位，激光粒度仪测量微泡粒径及粒径分布；细胞计数仪检测微泡的浓度；pH计测量微泡的pH值。

1.2.4 反向高效液相色谱法（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)测量包封率 PAD紫外双通道检测器；LC色谱分析软件；ZORBAX Eclipse XDB-C18；C18色谱柱（4.6 μm×250 mm，300 A，粒径5 μm）；甲酸、乙腈均为HPLC纯。流动相A为（含0.05%甲酸的超纯水），流动相B为乙腈；流动相比例为A∶B=75∶25，HPLC参数设置：柱温40℃，检测波长280 nm，流速1.0 mL/min，药物5 μL进样检测峰面积。采用RP-HPLC和超速离心法测定UK总量和游离UK量，按如下公式计算：包封率（%）=[（投入药量－游离药量）/投入药量]×100%。

1.3 统计学处理

应用SPSS19.0软件分析数据，计量资料以（均值±标准差）表示，检验，<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 微泡的肉眼及镜下观

UK载药微泡外观呈乳白色混悬液。在光学显微镜下可见微泡呈圆形，细密，分布均匀，无聚集现象；荧光显微镜下可见结合UK的微泡表面发出绿色荧光，普通微泡无荧光表现，见图1。

2.2 载药微泡的携带率

流式细胞仪分析结果显示，45 s振荡时间下UK的携带率最高，为（93.46±1.7）%，60和 90 s的携带率为（93.28±0.50）%、（92.21±1.7）%，15 s振荡时间下药物携带率最低，为（58.9±7.83）%，差异有统计学意义（<0.05），见图2。

图1 光镜（A）和荧光显微镜（B）观察稀释100倍后载FITC-UK微泡（×100）

图2 不同振荡时间下载药微泡携带率的比较（n=5）

2.3 UK效价检验

（2∶1）组、（1∶1）组、（1∶2）组、（1∶4）组的UK效价分别为（83.3±0.2）%、（84.0± 0.6）%、（89.3±0.2）%、（109.3±0.3）%。（1∶4）组的UK效价最高，达到合格标准。

2.4 微泡粒径及其分布

激光粒度测量仪检测可见，空白微泡的粒径为8.1 μm（8.1 μm，8.1 μm），分布稳定；载药微泡的粒径为10.54 μm（5.66 μm，25.17 μm），见图3。

2.5 微泡表面Zeta电位

马尔文表面电位测量仪检测空白微泡表面电位为（－28.76±3.15）mV，载药微泡的表面电位为（－56.47±8.23）mV，其表面电位的绝对值较空白微泡升高，差异有统计学意义（<0.05）。空白微泡、载药微泡的pH值分别为（5.78±0.02）、（6.20±0.01），差异无统计学意义（>0.05），见图4。

2.6 RP-HPLC检测包封率

载药微泡 UK的包封率为（52.5± 0.8）%，见图5。

3 讨论

近年来各种可携带药物或基因的超声微泡造影剂不断研制成功，超声介导微泡造影剂携带药物和基因靶向治疗技术的应用日益广泛，其机制主要是利用超声的“空化效应”。空化效应是指液体中存在的微小气泡（空化核）在超声作用下产生压缩和膨胀。超声微泡造影剂可被视为人造空化核，在低声压下，微泡产生对称性的压缩和膨胀，气泡的直径保持相对恒定而不破裂，称为稳态空化。在高声压下，微泡产生不对称的压缩和膨胀，最终发生内爆破裂，这种现象称为瞬态空化。在微泡造影剂发生瞬态空化的同时可伴随产生冲击波和微射流，使周围组织细胞膜发生可逆或不可逆的穿孔，增加细胞膜和微血管壁的通透性；与此同时，在冲击波和微射流的推动作用下，从破裂的微泡中释放出来的药物或基因更易进入组织细胞或靶器官。在超声作用下，微泡造影剂增强细胞的吞噬作用，从而使细胞对药物或基因的摄入能力显著增强。有研究把抑制沉默基因的质粒与微泡造影剂混合后注入小鼠体内，然后使用超声辐照已移植入小鼠体内的人宫颈癌细胞肿瘤，大大增加肿瘤细胞的凋亡，从而靶向治疗肿瘤组织[7]。因此，超声介导超声微泡造影剂携带药物和基因靶向治疗技术具有高效和靶向性强的优点。另外，微泡造影剂在血中的溶解度和弥散度差、稳定性好，使用微泡造影剂携带药物，可避免药物在血液循环中被迅速降解，从而减少药物用量，减少药物的副作用、降低治疗费用。部分临床试验证实，同时应用微泡造影剂可降低超声治疗的强度，从而提高超声助溶的效率和降低出血等副作用，而且体内使用微泡造影剂是安全的[8,9]。若把该技术应用于急性脑梗死的治疗，应该具有广阔的前景。

图3 空白微泡（A）及载药微泡（B）粒径分布图

图4 载药微泡的表面Zeta电位图

图5 进样5 μL的峰面积

人UK是近年研制成功的国家Ⅰ类新药，可提高急性脑梗死后脑的储备能力，改善预后，且时间窗宽广、无继发出血的副作用，目前已被最新版的《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》列为急性脑梗死的治疗药物之一。因此，UK可作为发挥超声介导微泡造影剂携带药物靶向治疗技术优势的理想药物。

本实验采用的微泡是注射用SF6，本品组成为白色冻干粉末，上充SF6气体；冻干粉末辅料组成：聚乙二醇4000、二硬脂磷酯酰胆碱、二棕榈磷酯酰甘油、棕榈酸。SF6是一种惰性无毒气体，在水溶液中溶解度极低，注射后2 min内，80%的SF6气体排出；注射15 min后，几乎所有的SF6气体都已排出，因此安全性高，无细胞毒作用。制备UK载药微泡是关键环节，目前国内外常用的载药微泡的制备方法有机械振荡法、冷冻干燥法、中和法、吸附法、声空化法和薄膜水化法等。多数文献认为机械振荡法稳定、制备工艺简单、控制性好，可获得较高的转染率[10]。因此，本研究采用机械振荡法制备UK载药微泡，且采用不同的振荡时间及不同的药物/微泡混合比，试图探索一种能使载药微泡携带率最高且药物活性最高的条件。本研究结果表明，机械振荡30 s以上，可将UK成功地连接在微泡上，荧光显微镜下可见载药微泡发出绿色荧光，普通微泡则无荧光表现。流式细胞仪检测结果显示载药微泡有较高的药物携带率。但是，本研究尚不能确定药物是黏附在微泡表面还是包裹进入微泡脂质膜内。Zeta电位测量结果显示，载药微泡的表面Zeta电位明显下降，所以笔者初步推测，带负电的UK有相当一部分是黏附在微泡表面。Zeta电位的重要意义在于它的数值与胶态分散的稳定性相关，分子或分散粒子越小，Zeta电位（正或负）越高，体系越稳定。一般认为，当Zeta电位的绝对值达30 mV，体系稳定[11]。空白微泡粒径平均值为8.1 μm，标准差为0，大小分布稳定，而载药微泡与空白微泡相比，粒径有所增加，且粒径分布较空白微泡广泛，这也从另一个角度解释了UK的携带部位可能位于微泡表面。

UK被微泡造影剂成功携带是制备载药微泡技术的关键环节，而保持UK的活性更是核心所在。本实验尝试了4种不同的UK与微泡的混合比，通过吸光度检测法检测A405nm值并计算出载药微泡中UK的效价，实验结果表明，在混合比为4∶1的情况下，UK效价达到药物合格标准。

综上所述，本实验基本成功制备UK载药微泡，其形态规则，分散情况良好，性质较稳定，为进一步应用超声介导微泡携带UK靶向治疗急性脑梗死提供技术平台。

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Preparation of Kallidinogenase-loaded Microbubbles using Mechanical Shaking Method

Objective:To investigate the optimal parameters for preparing Kallidinogenase-loaded microbubbles (KLMs)by mechanical shaking method.Methods:Kallidinogenase-loaded microbubbles were prepared using mechanical shaking method.Different shaking time and mixing ratio were used.The carrying rate and stability of Kallidinogenase were analyzed.The A405nmvalue of the Kininogenase was tested and calculated for the assay of the Kallidinogenase.The characterization and properties(appearance,surface potential,size,distribution,concentration,and pH value)of the microbubbles were observed.The enclosed efficiency of Kininogenase was detected. Results:The best shaking time was 45 s with carrying rate of(93.46±1.7)%.Kininogenase assay was up to standard when the Kininogenase and microbubbles mixture ratio was 4∶1.The mean surface potential was(－56.47± 8.23)mV,the mean diameter was(13.2±7.3)μm，ranged from 6～20 μm.The concentration was(6～7)×108/mL, pH value was(6.20±0.01),the drug enclosed efficiency was（52.5±0.8）%.Conclusion:The Kallidinogenase-loaded microbubbles,with ideal characters of safety and efficacy,could be successfully prepared via mechanical shaking method.

Kallidinogenase;microbubbles;mechanical shaking

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.003

广州医科大学附属第三医院a.神经内科b.超声医学科广州 510150

广东省自然科学基金面上项目（No.S201101000329 5）

2013-11-04

梁燕玲elaine.liang@163.com