重复经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马胆碱能系统的影响

张小乔，李鹂，刘伟，陈敏

重复经颅磁刺激对血管性痴呆大鼠学习记忆功能及海马胆碱能系统的影响

张小乔a，李鹂b，刘伟a，陈敏a

目的：观察重复经颅磁刺激（rTMS）对血管性痴呆（VaD）大鼠学习记忆功能及海马胆碱能系统的影响，并探讨其可能的作用机制。方法：雄性SD大鼠54只，随机分为对照组、模型组、rTMS组，每组18只。采用两血管阻断法制作VaD模型，对照组仅分离暴露双侧颈总动脉而不结扎。rTMS组于制模成功后给予rTMS治疗，模型组模拟rTMS固定大鼠头部放置线圈但不给予脉冲磁刺激。各组在造模第30天应用Morris水迷宫试验检测学习记忆能力，测定海马内乙酰胆碱酯酶（AChE）及胆碱乙酰转移酶（ChAT）的活性，行海马CA1区胆碱酯酶阳性纤维染色及密度测定，应用免疫组化技术检测海马CA1区脑源性神经营养因子（BDNF）的表达。结果：与模型组相比，rTMS组水迷宫逃避潜伏期明显缩短（＜0.05），相同时间内在原平台象限跨越相应平台次数明显增多（＜0.05）；与对照组相比，模型组及rTMS组AChE及ChAT的活性均明显降低（＜0.05）；与模型组相比，rTMS组AChE及ChAT的活性均明显增加（＜0.05）；rTMS组海马CA1区乙酰胆碱酯酶阳性纤维的密度及BDNF的表达均较模型组明显增强（＜0.05）。结论：rTMS能改善VaD大鼠学习记忆功能，机制可能与rTMS治疗能促进海马CA1区BDNF的表达、恢复海马胆碱能系统活性有关。

重复经颅磁刺激；血管性痴呆；学习记忆功能；海马；胆碱能系统

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是一组由脑血管疾病导致的智能及认知功能障碍综合征，是老年期痴呆的常见类型。VaD的发病机制尚未完全明确，有研究表明VaD时脑内胆碱能神经系统功能发生紊乱，反映胆碱能系统活性的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AChE）及胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase，ChAT）的活性发生改变[1,2]，这也是目前胆碱酯酶抑制剂如多奈哌齐、卡巴拉汀等药物治疗VaD的理论基础。在此基础上探索新的治疗方法具有重要研究价值。重复经颅磁刺激（repeated transcranialmagnetic stimulation，rTMS)是上世纪80年代兴起的一种神经电生理技术，最初用于受损神经功能的检测和评估，对抑郁症、帕金森病及脑梗死等神经精神疾病也有治疗作用[3-5]。rTMS对VaD的疗效目前报道较少。本研究观察rTMS对VaD大鼠学习记忆功能及海马胆碱能系统活性的影响，为rTMS应用于VaD的治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及分组 健康雄性SD成年大鼠54只，由湖北医药学院实验动物中心提供，体质量200～250 g，鼠龄12周。采用随机数字表法将大鼠随机分为对照组、模型组和rTMS组，每组18只。

1.1.2 主要试剂和仪器 兔抗脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）单克隆抗体（1∶500），生物素标记的山羊抗兔IgG及SP试剂盒（购于美国Sigma公司）；AChE、ChAT检测试剂盒及考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒（购于南京建成生物工程研究所）；Maglite Compact磁刺激器（购于丹麦Dantec公司）。

1.2 方法

1.2.1 VaD动物模型制备 参照Ni等[6]采用双侧颈总动脉结扎两血管阻断法将模型组及rTMS组大鼠制作慢性脑灌注不足所致的痴呆模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉，仰卧固定于手术台，经颈正中切口，分离、暴露双侧颈总动脉，双重丝线结扎，缝合皮肤。对照组仅分离、暴露双侧颈总动脉而不结扎。

1.2.2 rTMS治疗方法 rTMS组于制模后第 2天给予 rTMS治疗。采用 Maglite Compact磁刺激器，线圈直径为12 cm，峰值刺激强度为1.9 T，脉冲时限为100 μs，选择70%的最大刺激强度（1.33 T）刺激大鼠双侧大脑半球（线圈紧贴头皮，线圈平面与大脑半球呈相切关系），刺激频率为0.5 Hz，每侧刺激30次为1个序列，每日2个序列，左右各1个序列，时间间隔8 h，连续治疗28 d。模型组模拟rTMS固定大鼠头部放置线圈但不给予脉冲磁刺激。

1.2.3 学习记忆功能测试 各组大鼠于术后第30天进行Morris水迷宫测试。Morris水迷宫为一圆形水池，直径200 cm，高50 cm，水深30 cm，盛水后按1%比例加入奶粉使其变成不透明的乳白色，水温控制在（20～24）℃。水池分为东、西、南、北4个象限，由此固定4个入水点，任选一象限放置一直径为12 cm、高度为28 cm的平台。每天将大鼠按东、南、西、北4个入水点依次放入水池中，同时记录其在180 s内寻找平台的时间（逃避潜伏期）。如180 s仍未找到平台，则人为引导大鼠到达平台，并停留60 s，本次成绩记作180 s。Morris水迷宫测试每天1次，共训练4 d，实验第5天将平台撤走，进行大鼠180 s内穿越原平台位置的次数测试，即空间探索实验。

1.2.4 AChE和ChAT活性测定 学习记忆功能测试结束后当天，每组各取6只大鼠，用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后，迅速断头取脑，冰盒中快速分离一侧海马结构并称重，加9倍重量4℃生理盐水制备10%匀浆，离心后取上清液。ChAT活性测定是以乙酰辅酶A和胆碱为底物，在ChAT的作用下，反应的生成物和显色剂结合，测定结合物的吸光度，以此计算ChAT的活性。AChE活性测定是根据AChE水解乙酰胆碱（acetylcholine，Ach）生成胆碱和乙酸，胆碱可以与巯基显色剂反应生成黄色的对称三硝基苯，然后依据颜色深浅进行比色定量，其中AChE试剂盒说明书规定需另行匀浆蛋白定量分析，从而计算出每毫克蛋白所含AChE活性。匀浆蛋白定量分析用考马斯亮蓝法。

1.2.5 胆碱酯酶阳性神经纤维组织化学染色及密度测定 各组大鼠取6只深度麻醉后用4%多聚甲醛常规灌注固定，取海马区行连续冠状位冰冻切片，片厚30 μm，冰冻切片贴片后用PBS漂洗2次，每次5 min，加入孵育液（碘化乙酰硫胆碱6.25 mg，0.82%醋酸钠7.9 mL，0.6%醋酸0.25 mL，2.94%枸橼酸钠 0.6 mL，0.75%硫酸铜1.25 mL，0.165%铁氰化钾1.25 mL，0.137%四异丙基焦磷酰胺0.25 mL，双蒸水1 mL），37℃孵育2 h，然后PBS洗2次，每次5 min，终止反应。加DAB 5 mg，Tris-HCL 1 mL，3%硫酸镍铵10 mL，H2O21 mL加强显色15 min，用PBS洗2次，每次5 min，终止反应。常规脱水、透明、封片。在光镜下观察海马CA1区胆碱酯酶阳性神经纤维密度的变化，用HPIAS-1000型彩色计算机图像分析系统测定其平均光密度值。

1.2.6 免疫组化检测海马CA1区BDNF的表达 各组另外6只大鼠在学习记忆功能测试结束后用过量的10%水合氯醛深度麻醉，开胸经左心室插管至升主动脉，先用100 mL生理盐水快速冲洗血液，接着用4%多聚甲醛PBS 400 mL灌注固定，然后将动物断头取脑，置4%多聚甲醛中后固定过夜。之后石蜡包埋，行连续冠状位切片。取海马相同层面的标本行免疫组化SP法检测BDNF的表达：切片常规脱蜡至水后加入3%H2O2甲醇溶液，室温孵育10 min；加入正常山羊血清封闭，室温20 min；然后加入兔抗BDNF单克隆抗体，置湿盒4℃过夜；加生物素标记的二抗孵育，室温10 min；加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液，室温孵育10 min；然后滴加新鲜配制的DAB-H2O2显色液，室温显色5～10 min，苏木素复染核，自来水冲洗，脱水、透明、中性树胶封片。标本置于200倍显微镜下镜检，随机取5个视野照相，采用图像分析软件进行分析。BDNF染色以细胞浆内出现棕褐色颗粒者为阳性，分别对各组阳性细胞数量进行统计，每份标本的阳性细胞数取5个视野的平均值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠Morris水迷宫试验测试结果

在训练测试的第2、3、4天，各组大鼠逃避潜伏期均有缩短的趋势，以对照组及rTMS组更明显。与模型组相比，rTMS组连续4 d逃避潜伏期均明显缩短（＜0.05），而且相同时间内在原平台象限跨越相应平台次数明显增多（＜0.05），表明rTMS组学习记忆能力较模型组恢复明显。与对照组相比，rTMS组逃避潜伏期仍较长（＜0.05），相同时间内在原平台跨越相应平台次数仍较少（＜0.05），这表明rTMS组大鼠的学习记忆能力尚未恢复到正常水平，见表1。

表1 3组大鼠Morris水迷宫测试结果比较（±s）

表1 3组大鼠Morris水迷宫测试结果比较（±s）

注：与对照组比较，①?＜0.05；与模型组比较，②＜0.05

组别只数逃避潜伏期/s穿越平台次数/次1 d2 d3 d4 d，，对照组 1 2 3 6 . 5 8 ± 1 4 . 0 5 1 9 . 3 4 ± 1 0 . 1 6 1 3 . 7 2 ± 9 . 2 8 1 0 . 9 7 ± 6 . 4 5 9 . 3 4 ± 2 . 0 2 5 . 9 2 ± 1 . 0 6①r T M S组 1 2 4 7 . 3 2 ± 1 5 . 4 4② 3 7 . 2 0 ± 1 4 . 7 6①② 2 5 . 1 6 ± 1 1 . 5 5①② 2 1 . 4 8 ± 9 . 9 0①② 8 . 2 5 ± 1 . 7 5①②模型组1 2 1 0 2 . 7 0 ± 2 4 . 6 5①9 3 . 4 2 ± 1 9 . 2 2①8 4 . 0 5 ± 1 7 . 3 0①8 5 . 6 6 ± 1 6 . 8 1①

2.2 海马AChE和ChAT活性测定结果

与对照组相比，模型组及rTMS组AChE和ChAT活性均明显减低（＜0.05）；与模型组相比，rTMS组AChE和ChAT显著增强（＜0.05），见表2。

2.3 海马CA1区胆碱神经纤维染色及密度测定

对照组海马CA1区可见密集、分布均匀的胆碱酯酶阳性纤维，模型组及rTMS组海马CA1区胆碱酯酶阳性纤维稀疏，密度均明显下降（＜0.05）；与模型组相比，rTMS组海马CA1区胆碱酯酶阳性纤维密集，密度明显增加（＜0.05），见表2、图1。

2.4 海马CA1区BDNF表达比较

各组大鼠海马CA1区均可见一定数量BDNF阳性表达细胞，模型组及rTMS组海马CA1区BDNF的表达均明显低于对照组，差异具有统计学意义（＜0.05）；和模型组相比，rTMS组BDNF的表达增加，差异具有统计学意义（＜0.05），见表2、图2。

表2 3组大鼠海马AChE和ChAT活性、CA1区胆碱神经纤维、BDNF比较（±s）

表2 3组大鼠海马AChE和ChAT活性、CA1区胆碱神经纤维、BDNF比较（±s）

注：与对照组比较，①＜0.05；与模型组比较，②＜0.05

组别只数A C h E /（U / m g p r o）C h A T /（U / g）胆碱纤维吸光度值B D N F阳性细胞数/个对照组 6 0 . 6 1 ± 0 . 0 8 1 4 9 . 2 5 ± 1 1 . 8 4 2 . 3 6 ± 0 . 1 2 2 7 . 8 3 ± 0 . 7 5模型组1 4 . 3 3 ± 1 . 6 3①r T M S组 6 0 . 4 9 ± 0 . 0 7①② 1 2 6 . 9 0 ± 1 0 . 7 6①② 1 . 9 8 ± 0 . 1 1①② 2 3 . 1 7 ± 1 . 1 7①②6 0 . 3 2 ± 0 . 0 5①1 0 5 . 4 6 ± 8 . 2 4①1 . 5 7 ± 0 . 0 9①

图1 对照组（A）、模型组（B）、rTMS组（C）海马CA1区胆碱酯酶阳性神经纤维（亚铁氰化铜染色，×100）

图2 对照组（A）、模型组（B）、rTMS组（C）海马CA1区BDNF阳性细胞表达（SP染色，×200）

3 讨论

海马是大脑边缘系统中参与学习记忆的重要结构，其中海马CA1区是信息加工、整合、强化、传递的重要区域，且与胆碱能系统密切相关。有学者提出中枢胆碱能突触是记忆的结构和生理学基础，脑内Ach是迄今发现的与学习记忆关系最为密切的一种神经递质[7]。AChE是ACh的水解酶，其活性反映ACh水平变化；ChAT是ACh合成的主要酶，其活性的高低与ACh合成的水平密切相关。通过测定AChE和ChAT的活性可反映脑内胆碱能系统的功能。海马尤其是海马CA1区对缺血、缺氧非常敏感，是脑缺血易损区。近年来许多研究已证实，VaD存在明显的胆碱能系统紊乱，AChE和ChAT的活性降低[8,9]，可能与胆碱能神经元对缺氧耐受性差有关。胆碱能系统的紊乱被认为是导致VaD认知障碍的原因之一。

本研究发现，与对照组相比，模型组AChE和ChAT活性均明显降低，同时海马CA1区胆碱酯酶阳性纤维密度明显减低，提示VaD模型大鼠存在明显的胆碱能神经纤维受损及功能异常，从而导致其学习记忆能力明显下降。rTMS组大鼠AChE和ChAT活性明显得到恢复，而且海马CA1区胆碱酯酶阳性纤维密度明显增加，表明rTMS治疗之所以能改善VaD大鼠学习记忆功能可能与其提高胆碱能系统的活性有关。

rTMS的主要原理是磁电转换，具有多种生物学效应：能刺激和兴奋组织、细胞，加强其功能联系；降低突触传导的阈值，形成新的传导通路；调节神经元兴奋性、神经递质和肽类物质的代谢，影响脑神经递质水平；能增加局部脑血流量，增强急性脑缺血大鼠梗死灶周围神经营养因子分泌，减少缺血灶周围神经细胞的凋亡[10-12]。相对于脑梗死所造成的脑组织急性缺血缺氧而言，本研究通过结扎双侧颈总动脉制作的VaD模型是一种低灌注造成的慢性全脑缺血缺氧性状态，虽然有区别，但有类似之处。本研究发现，rTMS能促进VaD大鼠海马CA1区BDNF的表达，这在保护因慢性脑缺血缺氧所造成的海马胆碱能神经元的损伤及胆碱能纤维的缺失、恢复海马胆碱能系统的活性中发挥重要作用。rTMS可通过磁场的变化转换为生物电效应，影响神经细胞的代谢和蛋白质的合成，笔者在之前的研究中也发现rTMS可调节第二信使c-fos的表达从而促进脑缺血大鼠皮质BDNF的表达[12]。关于rTMS促进脑部BDNF表达的确切机制有待进一步研究。

rTMS治疗脑梗死的参数多倾向于应用低频率和中等强度的刺激，本研究选择频率为0.5 Hz、强度为1.33 T的刺激参数，同时也是笔者既往相关研究所选择的参数[12]。研究表明对缺血性脑血管疾病而言，低频率和中等强度的rTMS刺激不仅有效，而且安全性好，不会导致癫痫发作[12-14]。何种刺激频率和强度能达到对VaD的最佳治疗效应，需进一步研究。

[1]Xiao Y,Guan ZZ,Wu CX,et al.Correlations between cholinesterase activity and cognitive scores in post-ischemic rats and patients with vascular dementia [J].Cell Mol Neurobiol,2012,32:399-407.

[2]Perry E,Ziabreva I,Perry R,et al.Absence of cholinergic deficits in"pure"vascular dementia[J]. Neurology,2005,64:132-133.

[3]Tarhan N,Sayar FG,Tan O,et al.Efficacy of high-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation in treatment resistant depression[J].Clin EEG Neurosci,2012,43:279-284.

[4]Yang YR,Tseng CY,Chiou SY,et al.Combination of rTMS and treadmill training modulates corticomotor inhibition and improves walking in Parkinson disease:a randomized trial[J].Neurorehabil Neural Repair,2013,27:79-86.

[5]沈滢,单春雷,殷稚飞,等.不同频率重复经颅磁刺激对脑梗死上肢功能的影响[J].中国康复医学杂志,2012,27:997-1001.

[6]Ni J,Ohm H,Matsumoto K,et al.Progressive cognitive impairment following chronic cerebral hypoperfusion induced by permanent occlusion of bilateral carotid arteries in rats[J].Brain Res,1994, 653:231-236.

[7]Gu Z,Lamb PW,Yakel JL.Cholinergic coordination of presynaptic and postsynaptic activity induces timing-dependent hippocampal synaptic plasticity[J].J Neurosci,2012,32:12337-12348.

[8]Kumaran D,Udayabanu M,Kumar M,et al.Involvement of angiotensin converting enzyme in cerebral hypoperfusion induced anterograde memory impairment and cholinergic dysfunction in rats[J]. Neuroscience,2008,155:626-639.

[9]张泰鹏,莫雪安,刘金萍,等.甘露醇对骨髓间充质干细胞治疗血管性痴呆大鼠行为学及海马胆碱能系统的影响[J].中风与神经疾病杂志,2011,28: 317-320.

[10]O'Shea J,Walsh V.Transcranial magnetic stimulation[J].Curr Biol,2007,17:R196-199.

[11]Yoon KJ,Lee YT,Han TR.Mechanism of functional recovery after repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS)in the subacute cerebral ischemic rat model:neural plasticity or anti-apoptosis?[J].Exp Brain Res,2011,214:549-556.

[12]张小乔,梅元武,刘传玉.经颅磁刺激对脑梗死大鼠皮质c-Fos和BDNF表达的影响[J].中华物理医学与康复杂志,2006,28:86-89.

[13]许涛,郭正成.经颅磁刺激用于实验性脑缺血的安全性研究[J].中国康复,1999,14:193-195.

[14]Khedr EM,Fetoh NA.Short-and long-term effect of rTMS on motor function recovery after ischemic stroke[J].Restor Neurol Neurosci,2010,28: 545-559.

Effects of Repetitive Transcranial Magnetic Stimulation on the Abilities of Learning and Memory and the Cholinergic System of Hippocampus Formation in Rats with Vascular Dementia

Objective:To investigate the effects of repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS)on the abilities of learning and memory and the cholinergic system of hippocampus formation in rats with vascular dementia(VaD).Methods:Fifty-four male SD rats were randomly divided into control,VaD model and rTMS groups with 18 rats in each group.The VaD rats were established with two vessel occlusion method whereas bilateral carotid arteries were only exposed without ligation in the control group.The animals in the rTMS group were given rTMS treatment.The rats in the model group were treated by simulated rTMS and fixed head coil without impulse magnetic stimulation.Morris water maze(MWM)test was performed to evaluate learning and memory function of rats on the day 30 after two vessel occlusion.The activity of AchE and ChAT,the density of AChE-positive staining fiber and the expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)in hippocampus were investigated.Results:The MWM escape latency in the rTMS group was shorter than that in the model group (<0.05).The number of crossing the corresponding platform during the same time period in platform quadrant in the rTMS group was significant more than that in the model group (<0.05).The activity of AchE and ChAT was decreased significantly in the model group compared with those in the control group,whereas it was improved significantly in the rTMS group (<0.05).The density of AChE-positive staining fiber and the expression of BDNF in the rTMS group were higher than those in the model group (<0.05).Conclusion:rTMS can ameliorate learning and memory deficit of rats with VaD,perhaps by way of increased expression of BDNF in hippocampus CA1 area and repair of hippocampal cholinergic system activity.

rrepetitive transcranial magnetic stimulation;vascular dementia;function of learning and meory; hippocampus;cholinergic system

R741;R741.05

A DOI 10.3870/sjsscj.2014.02.004

湖北医药学院附属太和医院a.干部病房神经内科，b.药学部湖北十堰 442000

湖北省教育厅中青年人才项目（No.Q20092404）十堰市太和医院博士启动基金、院级基金（No.2012ZDFX01）

2013-07-02

张小乔little_bridge@126. com