生物传感器在海洋红酵母发酵生产中的应用

■周万里 朱思荣 高广恒 史建国 毕春元

(1.山东省科学院生物研究所，山东济南250014；2.山东省科学院中日友好生物技术研究中心，山东济南250014)

海洋红酵母不仅含有丰富的蛋白质、氨基酸、维生素，而且还能产生胡萝卜素和虾青素等，是高档水产品肌肉色素的主要来源。目前国内海洋红酵母生产中，由于检测生物类参数的传感器缺乏,一些对反应过程重要的生物变量不能在线测量，给发酵过程的控制带来了盲目性。要实现发酵生产过程优化控制，首先解决生物反应过程相关生物量的在线检测问题[1]，这已成为发酵工业面临的主要技术瓶颈之一，发酵过程的在线检测和优化控制是提高工业发酵生产水平的有效途径。

目前发酵工业生产中通常采用两种方法实现生物量测量：一种是通过在线分析仪表，如HPLC、GC等，这类在线分析技术在不断发展，但在工业生产环境仍存在着维护工作量大、测试成本高、分析周期长、测量结果滞后等缺陷；另一种方法是采用离线分析测量[2]，即目前生产过程中常采用离线分析方法，每隔几小时采样一次送化验室进行人工分析，离线人工分析通常滞后几小时，难以满足生产要求。

生物传感器是生物识别单元与信号转换元件耦联形成的功能器件，以生物活性单元作为生物敏感膜，通过各种信号转换器捕捉待测物与敏感物质间的反应，是分析生物化学信息获取的重要工具。其中，固定化酶生物传感器已广泛应用于医药、食品、化工、环境、能源等领域，其特点是：特异性好，分析速度快，测定成本低，结果准确，可实现对复杂样品中特定生化组分的快速或在线检测[3]，这对解决发酵过程生化参数的在线检测提供了先进的技术支撑。

本文采用生物传感器分析方法，建立了葡萄糖、乳酸、乙醇等生化参数的在线检测技术，通过多传感器融合，实现了葡萄糖、乳酸、乙醇、pH值、OD等多参数在线分析系统[4]。该系统集合常规发酵罐所有功能的同时，还具有了对发酵过程中关键点监控的功能，为建立更科学的发酵控制数学模型[5]奠定了数据基础，有了更科学的控制模型可以更好地对发酵过程进行优化控制[6]，进一步满足发酵行业的需求。该在线检测系统在海洋红酵母高密度培养[7]生产中得以成功应用，采用葡萄糖母液为发酵原料，通过分析优化发酵过程数据，建立了流加反馈控制方法，为海洋红酵母发酵生产提供了新的检测控制模式[8]，也为生物传感器在线检测系统[9]在发酵行业的广泛应用奠定了基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

海洋红酵母菌，由山东省科学院生物研究所提供。

1.1.2 试剂

葡萄糖母液(潍坊盛泰药业有限公司提供)；氢氧化纳(化学级)；硫酸铜(分析纯)。

1.1.3 种子培养基

70 g/l葡萄糖、50 g/l蛋白胨、2 g/l磷酸二氢钾、0.5 g/l硫酸镁、5 g/l硫酸铵。

1.1.4 发酵培养基

10 g/l葡萄糖、35 mg/l氨基氮、2 g/l磷酸二氢钾、0.5 g/l硫酸镁、3 g/l硫酸铵。

1.1.5 主要仪器

CHI800电化学分析仪(上海辰华仪器公司)；GUJS-15-100C全自动发酵罐系统(镇江东方生物工程设备技术有限责任公司生产，控制系统自主研发安装)；在线无菌取样装置、智能稀释装置和生物量检测传感器，自制；高压蒸汽灭菌锅(北京盛达生物电子设备有限公司)；高温烘箱(上海精科仪器设备厂)；离心机(LD4-2A)；HYG-II型固转恒温调速摇瓶柜(上海新星自动化控制成套设备厂)；数码显微镜(奥林巴斯CX31型)。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

无菌条件下，将斜面保存的海洋红酵母菌种接入装有50 ml种子培养基的250 ml摇瓶中，置于摇床中以200 r/min震荡，30℃下培养18 h即可。将制备的种子液按5%的接种量接种至装有10 L发酵培养基的15 L全自动发酵罐中，发酵周期40 h，温度30～32℃，pH值 5.0，溶氧30%，初始葡萄糖浓度30 g/l，培养过程中通过流加葡萄糖维持发酵液中葡萄糖浓度为0.5 g/l、氨基氮浓度为40 mg/l。

1.2.2 生物敏感膜的制备

葡萄糖氧化酶0.03 U、20%牛血清白蛋白5 μl、2%戊二醛2 μl、均匀喷涂在载体膜圈表面,静置固化15 min，用蒸馏水洗去多余反应物，冷冻干燥即得。

1.2.3 配套试剂

缓冲剂：为保护酶膜并创造酶反应最适条件的专用辅助材料，用蒸馏水配制。

SBA三合一标准液：100 mg/dl葡萄糖、100 mg/dl乙醇、50 mg/dl乳酸混合标准液。

1.3 生物传感器在线检测系统

生物传感器在线监测系统主要包括：在线无菌自动取样装置、智能稀释装置、生物量检测传感器、常规发酵罐检测模块和人机交互控制界面等几大部分。

1.3.1 在线无菌取样装置（见图1）

图1 在线无菌取样装置

在开始发酵前，微开P23，AA1，发酵过程的取样完全由自动阀控制。自动取样过程如下：先开吹气阀A29和取样阀P25，净化空气通过取样管路进入发酵罐，经一定延时后关P25，开启夹断阀2和3，净化空气吹净取样管路内可能存在的水分。然后关闭吹气阀A29，打开取样阀P25，发酵罐内的发酵液在罐压的作用下排出，当管道内的液体检测器测到有发酵液到达后立即关闭夹断阀2，禁止发酵液继续外排，同时开气动阀P23，使P23后部的发酵液

回吹到发酵罐内。一定延时后关阀P25，留下P23和检测器之间的一段发酵液作为检测用发酵液。发酵罐自动取样间隙，取样管路充满净化空气，与取样口没有发酵营养液的连接，不易污染取样口，但为确保发酵不被污染，在长期发酵测试中，应每隔12 h对取样口进行一次灭菌操作，方法同前，灭菌操作应在自动分析系统完成取样后立即进行，在下次取样前完成操作。

1.3.2 智能稀释装置和生物量检测传感器（见图2）

图2 生物传感器自动稀释、检测反应装置

生物量的检测是通过自动采样、自动稀释、自动标定和自动测定实现，基于生化反应的测定体系是实现系统功能的关键。取样、稀释和测定主要由以下系统有机组合而成。

采样池用于发酵液的自动采样，本系统检测两个发酵罐，采样池是一体的两个直径9 mm的独立的小池，可以防止两个发酵罐发酵液的混合，发酵液通过取样蠕动泵从底部送入，发酵液的气泡和在取样过程中注入的空气从采样池上部自动逸出，样品测完成后，剩下的发酵液通过蠕动泵反转和电磁夹断阀切换流通管路，作为废液排出。

稀释池分二级，第一级固定稀释10倍，或20倍（总500倍稀释时），第一级稀释池同时用于光密度（OD）的测定。第二级则根据实际稀释倍数调整。由于稀释池清洗后有清洗水的残留，所以稀释过程需要减少加稀释水的量，以抵消残留水的影响。标样池仅用于存放标准液，是一个中心有取样孔的容器，自动分析过程中需要保证标样池中始终有标样，如标样用尽，则定标过程会出现酶活太低报警。

三电极反应池为生物传感器测量过程酶促反应提供测定环境，在反应池的左、右和后方各安装一支H2O2酶电极，反应池的前部安装缓冲液进、出口接口。反应池正中为反应腔，清洗过程缓冲液通过入口进入反应腔，再通过反应腔上方的锥形溢流帽排到废液腔，最后经排液出口排出到废液中。由于三电极系统反应池反应腔体积较大，在清洗前先通过排空接口把混有样品的缓冲液排空，加快清洗速度，并节约缓冲液的使用。

1.3.3 发酵过程在线检测系统整体构架（见图3）

图3 发酵过程在线检测系统

整个控制系统共有几大部分：信号采集模块、A/D转换模块、人机交互界面、中央控制单元、D/A转换模块、控制设备。整个系统的流程如下：首先通过信号采集模块即参数传感器（如温度传感器、OD传感器、溶氧电极、pH值电极、压力传感器、在线生物传感器等）采集到相应的信号，经由A/D转换模块进行A/D转换，转换完毕后传递到中央处理器C8051F120,中央控制器根据人机界面发出的控制指令，根据相应的控制算法进行计算后，将输出的控制信号传递给D/A转换模块，控制信号经D/A转换后传递给控制设备，从而实现对控制设备的控制。在该系统中上位机主要起到远程监控的作用。发酵过程主要需要控制的变量有温度、溶解氧含量、光密度、压力、底物、pH值、转速等。

1.3.4 发酵控制系统人机交互界面设计

发酵控制系统采用工业级彩色触摸液晶屏作为人机对话输入输出设备，显示屏为10.4寸TFT LED背光屏，所用的操作均通过仿WINDOWS的触摸控制实现，点击显示屏上的相应按钮，可以完成各种操作。

控制界面类似于WINDOWS的属性页，分为3个工作区，如图4所示。

界面上面为页头区，点击不同的页头，可以快速切换到不同的工作界面，当前显示页面页头为凸起状态，字符显示为黄色。由于页面不能在一行内显示，在页头的右侧有2个翻页按钮，可以切换显示的页头。页头区的最右侧，有2个按钮，用于A罐和B罐的切换，当前显示罐的按钮状态下按下状态，字符显示为黄色。控制界面的最下端为状态区，在状态区的左侧显示最后一次发酵的发酵时间，或在灭菌状态下显示灭菌计时。状态区的最右侧，显示当前时间日期信息。控制界面的中部为人机对话页面，用于数据显示和输入输出，本控制系统共有9个显示页面，分别为“主界面”、“发酵曲线”、“数据列表”、“发酵参数”、“电极标定”、“动态控制”、“SBA设置”、“SBA信息”和“系统设置”，每一页实现相应的功能。

图4 发酵控制系统人机交互界面

2 结果与讨论

利用生物传感器在线检测装置，实现了海洋红酵母发酵过程中葡萄糖、乳酸、乙醇、DO、pH值、OD等多参数在线动态显示如图5所示。

图5 海洋红酵母发酵过程动态显示

利用生物传感器在线检测系统确定海洋红酵母高密度培养的最佳工艺：最适培养温度为30～32℃；最适pH值为5.0；最适溶氧(DO)为30%；培养过程中通过流加补料维持发酵液中葡萄糖浓度为0.5 g/l、氨基氮浓度为40 mg/l。在此条件下，培养40 h后细胞干重最高可达56.6 g/l，细胞得率42.4%。

海洋红酵母使用生物传感器在线分析装置前后对比见表1。

表1 海洋红酵母发酵在线分析装置使用前后对比结果

3 小结

总之，SBA生物传感器在线分析系统实现多种生化参数的在线检测。该系统包括取样、样品预处理装置、液体泵、注射阀、传感器、信号转换和计算机。其测定方式为是安装在反应器外，被测样液经取样装置、稀释系统后被送至传感器检测单元，与生物传感器接触反应产生信号。

发酵过程在线检测技术的发展趋势是物理参数、化学参数和生物参数传感器的集成，使在线检测系统能用于检测培养介质特性的变化、代谢过程中能量变化、菌体的生长变化、原料的消耗和产物的合成过程。同时，应加强对测量参数及其变化意义的综合性理解，在基因水平、细胞水平和反应器工程水平等不同层次上认识和建立发酵过程分析的理论体系，切实可行地发挥在线检测技术在发酵工业中的应用效果。