单菌、混菌发酵果蔬饲料最佳工艺的研究

■杨 骏 陈生琴 王 婷 柳俊超 程茂基

（安徽农业大学动物科技学院，安徽合肥 230036）

众所周知，我国是一个水果蔬菜原产地大国，从1993年起，中国水果总产量超过印度、巴西、美国，连续21年稳居世界第一。我国现有的传统的果蔬加工技术有罐装、干制、腌制等，但这些技术在加工过程中果蔬的营养损失严重，且转化率不高。近年来，国内外逐渐出现了几种新的果蔬加工的方式，包括果蔬功能成分的提取、脱水等。利用我国传承千年的发酵工艺，发酵果蔬产品，不仅最大限度的保留了果蔬中的营养成分，改进了果蔬食用价值，将之利用在饲料中，不仅可以提高饲料蛋白质含量等营养因子，还能消除饲料中原有的不良气味，改善其适口性，增加畜禽采食量，提高饲料的营养价值。

近年来，国内外对发酵果蔬产品的研究不断加大，发酵果蔬产品的功能型也不断扩展，例如，发酵果蔬汁的一个典型保健功能就是调节胃肠道菌群，抑制有害菌的繁殖[1]。采用生物发酵技术应用于果蔬饮料和果蔬酱料的加工生产中，可有效改善蔬菜特有的“野蒿味”，使原料风味与发酵风味浑然一体，提高果蔬深加工产品的品质和营养价值，并且可有效防止果蔬酱发生褐变，还可使果蔬酱含糖量降低至10%以下[2]。大量资料显示，果蔬磨成的浆液经乳酸菌发酵后，其营养成分得到了良好的保留和细化。

现今，发酵果蔬产品也广泛应用于饲料工业，如杨福有、祁周约等[3-4]对苹果渣的化学成分、喂养效果进行了初步研究,籍保平、徐抗震等[5-8]对苹果渣发酵菌种选育、发酵培养基和发酵工艺进行了探讨。苹果渣发酵饲料作为苹果渣的合理利用方式之一[9]，目前的研究多集中在提高蛋白质的含量方面[6,10-12]。此外利用液体饲料可缓解断奶造成的应激，降低断奶仔猪的腹泻率，显著提高饲料转化率[13]，将果蔬原材料制成浓浆液后按比例加入液体饲料中发酵后，可增加饲料的芳香性气味，进一步提高饲料采食量，增加断奶仔猪的日增重。为此，本试验拟以益生菌发酵果蔬液体饲料，研究益生菌发酵果蔬液体饲料前后营养成分的比较，以期为开发出一种绿色、环保、健康的新型生物饲料提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种：本实验室保存的酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌。

1.1.2 果蔬产品选择：选取新鲜的番茄、胡萝卜、山楂、苹果，购于合肥周谷堆批发市场。

1.1.3 培养基

①酵母菌培养基-马铃薯培养基

马铃薯去皮 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂粉 20 g，蒸馏水 1 000 ml，自然pH值；

②枯草芽孢杆菌培养基-牛肉膏蛋白胨培养基

蛋白胨 10 g、牛肉膏 3 g、NaCl 5 g、琼脂粉 15～20 g，蒸馏水 1 000 ml，pH值7.4～7.6；

③植物乳杆菌培养基-MRS

蛋白胨10 g、牛肉膏10 g、酵母浸出膏20 g、无水乙酸钠5 g、柠檬酸二胺2 g、K2HPO42 g、七水合硫酸镁0.2 g、硫酸锰 0.05 g、吐温-80 1.0 g、琼脂粉 20 g、NaCl 5 g，pH值7.0～7.2，蒸馏水 1 000 ml。

1.2 试验方法

1.2.1 果蔬浓浆液的预处理

参照断奶仔猪营养需求，将玉米、豆粕、麸皮等饲料原料与水混合，水料比2.5∶1，制成半成品液体饲料。后将等质量的番茄、胡萝卜、山楂、苹果（去皮、核），用匀浆机打碎后静置，加少量水调制成浓浆升温浸泡、灭菌、降温后，加入配置好的液体饲料，加入比例为4%。待接入实验菌种。

1.2.2 果蔬浓浆液体饲料发酵前指标的测定

接入菌种前测定果蔬浓浆液体饲料的粗蛋白、粗纤维、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

1.2.3 培养基的优化

1.2.3.1 酵母菌浓浆发酵条件优化试验

将500 g浓浆液体饲料装入密封塑料桶中（敞开封口并好氧发酵），置于振荡培养箱中，以发酵温度30℃、接种量2%、发酵时间60 h、pH值5的基础上，分别考察发酵时间（24、36、48、60、72、84 h）、发酵温度（27、28、29、30、31、32 ℃）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）、pH值（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）对果蔬浓浆液的影响。在单因素试验的水平上，根据各因素对浓浆液体饲料中生物量的影响，设计4因素3水平正交试验L9(34)，对发酵条件进行正交优化试验，确定酵母菌对浓浆液的最佳发酵组合条件。酵母菌浓浆发酵正交试验因素水平见表1，并在最佳优化条件下测定其粗蛋白、粗纤维、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表1 酵母菌浓浆发酵正交试验因素水平

1.2.3.2 枯草芽孢杆菌浓浆发酵条件优化试验

将500 g浓浆液体饲料装入密封塑料桶中（敞开封口并好氧发酵），置于振荡培养箱中，以发酵温度30℃、接种量2%、发酵时间60 h、pH值5的基础上，分别考察发酵时间（24、36、48、60、72、84 h）、发酵温度（27、28、29、30、31、32 ℃）、接种量（1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%）、pH值（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）对果蔬浓浆液的影响。在单因素试验的水平上，根据各因素对浓浆液生物量的影响，设计4因素3水平正交试验L9(34)，对发酵条件进行正交优化试验，确定枯草芽孢杆菌对浓浆液的最佳发酵组合条件。枯草芽孢杆菌浓浆发酵正交试验因素水平见表2，并在最佳优化条件下测定其粗蛋白、粗纤维、pH值、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表2 枯草芽孢杆菌浓浆发酵正交试验因素水平

1.2.3.3 植物乳杆菌浓浆发酵条件优化试验

将500 g浓浆液体饲料装入密封塑料桶中（厌氧发酵），置于振荡培养箱中，以发酵温度40℃、、接种量3%、发酵时间72 h、pH值5的基础上，分别考察发酵时间（24、48、72、96、120 h）、发酵温度（38、39、40、41、42℃）、接种量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%）、pH（4.0、4.5、5.0、5.5 和6.0）对果蔬浓浆液生物量的影响。在单因素试验的水平上，根据各因素对浓浆液的影响，设计4因素3水平正交试验L9(34)，对发酵条件进行正交优化试验，确定植物乳杆菌对浓浆液的最佳发酵组合条件。植物乳杆菌浓浆发酵正交试验因素水平见表3，并在最佳优化条件下测定其粗蛋白、粗纤维、pH、乳酸含量、生物量、Ca、P含量。

表3 植物乳杆菌浓浆发酵正交试验因素水平

1.3 混菌发酵果蔬液体饲料发酵条件优化实验

将500 g(水料比2.5∶1)果蔬液体饲料装入密封塑料桶中，总发酵时间分别为72 h、好氧厌氧发酵时间比例为1∶1，好氧期间温度为30℃，厌氧期间温度为40℃，三种菌的接种总量为10%，酵母菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌接种量比例依次为3%、4%、3%，探究混菌发酵前后对果蔬液体饲料营养价值的影响。1.4 指标的测定

1.4.1 粗蛋白测定采用凯氏定氮法。

1.4.2 粗纤维测定方法。

1.4.3 乳酸的测定

发酵样品预处理：取适量发酵样品与等量的水混合均匀后，在5 000 r/min离心10 min，以除去菌体和碳酸钙沉淀,吸取上清夜0.5 ml经适当稀释后，吸取上清液2 ml于洁净离心管中，加入2 ml钨酸溶液，混匀，室温静置，直至溶液中出现明显絮状物，10 000 r/min离心10 min，取上清夜置于10 min洁净离心管中，60℃水浴保温30 min左右，冷却待用。

发酵样品测定：精确吸取5 ml待测液于具塞试管中，加入0.05 g氢氧化钙，混匀，然后加入0.8 m1 20%的硫酸铜，迅速混匀，沸水浴3 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液0.5 ml于比色管中加入6 ml浓硫酸，混匀，沸水浴加热5 min，取出后冰水浴冷却加入1.5%的对羟基联苯溶液0.125 ml，充分混合,静置30 min置于沸水浴加热5 min，冰水浴冷却，以蒸馏水为参比液，在565 nm处测定其吸光度。

1.4.4 生物量的测定

无菌称取样品25.0 ml，放入含有225 ml稀释液的灭菌三角瓶中，充分振荡20～30 min后，制成10-1的稀释液。用移液枪吸取10-1稀释液1 ml于9 ml稀释液的1号试管中，混合均匀，制成10-2稀释液，依次制成10-2～10-3不同梯度的稀释液（每做1个稀释度都必须更换1个枪头）。每个样品选2个稀释度，取1 ml菌悬液于相应编号的无菌平皿内，每个稀释度做2个平皿，再倒入已冷至45℃的各自培养基15～20 ml，边倒边摇，使菌液与培养基混合均匀。待培养基凝固后，将培养皿倒转，放入30℃培养箱中培养3 d后计数。

1.4.5 钙、磷的测定参照张丽英《饲料分析及饲料质量检测技术》的方法检测。

1.4.6 pH值的测定使用STARTER 300型便携pH计测定上清液pH值。

2 结果与分析

2.1 酵母菌浓浆液体饲料发酵条件的优化

酵母菌浓浆液体饲料发酵条件的正交试验和方差分析见表4～表6。

由表4的正交试验可以看出，影响发酵效果中生物量的4个主要因素的主次顺序是：时间＞温度＞pH值＞接种量，最佳组合是：A2B2D3C3。即最佳优化条件为发酵时间60 h、温度30℃、pH值6.0、接种量3%。

其中发酵时间对酵母菌生物量的影响有显著差异（P＜0.05），浓浆液饲料在发酵时间达到72 h后，发酵液底物中的营业物质也被大量消耗从而不能满足酵母菌的生长需要，微生物生长进入稳定期。而发酵温度、接种量、pH值则对酵母菌生物量的影响不显著（P＞0.05）。

表4 酵母菌浓浆液体饲料发酵条件正交试验的直观分析

表5 方差分析

在最佳优化条件下，即发酵时间60 h、温度30℃、pH值6.0、接种量3%的条件下的酵母菌生物量为91.54×106cfu/ml（见表6），此外粗蛋白含量比发酵前上升6.59%，粗纤维含量减小20.83%，乳酸含量增加约7.38倍，钙、磷含量也有不同程度的增加。

表6 发酵前后营养成分对比

2.2 枯草芽孢杆菌浓浆液体饲料发酵条件的优化

枯草芽孢杆菌浓浆液体饲料发酵条件的正交试验和方差分析见表7～表9。

表7 枯草芽孢杆菌浓浆液体饲料发酵条件正交试验的直观分析

由表7的正交试验可以看出，影响发酵效果中生物量的4个主要因素的主次顺序是：温度＞发酵时间＞pH值＞接种量，最佳组合是：B2A2D2C3。即最佳优化条件为温度30℃、发酵时间60 h、pH值5、接种量4%。

结果表明，发酵温度和时间对枯草芽孢杆菌的微生物量影响有显著差异（P＜0.05），其中发酵温度对生物量的影响最显著。而pH值、接种量对枯草芽孢杆菌的微生物量的影响不显著（P＞0.05）。影响枯草芽孢杆菌的生物量因素的主次顺序是：温度＞发酵时间＞pH值＞接种量，这与正交试验的极差分析结果相吻合。

表8 方差分析

在最佳优化条件下，即温度30℃、发酵时间60 h、pH值5、接种量4%的条件下的枯草芽孢杆菌生物量为126.39×106cfu/ml（见表9），此外粗蛋白含量比发酵前上升8.24%，粗纤维含量减小12.5%，乳酸含量成几何倍数增加，钙、磷含量同样也有不同程度的增加。

表9 发酵前后营养成分对比

2.3 植物乳杆菌浓浆液体饲料发酵条件的优化

植物乳杆菌浓浆液体饲料发酵条件的正交试验和方差分析见表10～表12。

表10 植物乳杆菌浓浆液体饲料发酵条件正交试验的直观分析

表11 方差分析

表12 发酵前后营养成分对比

由表10的正交试验可以看出，影响发酵效果中生物量的4个主要因素的主次顺序是：发酵时间＞温度＞pH值＞接种量，最佳组合是：A2B2C3D3。即最佳优化条件为发酵时间60 h、温度40℃、接种量3%、pH值6。

其中，发酵时间和温度对植物乳杆菌的微生物量影响均有显著差异（P＜0.05），其中发酵时间对生物量的影响最显著。影响植物乳杆菌的微生物量因素的主次顺序是：发酵时间＞温度＞接种量＞pH值，这与正交试验的极差分析结果相吻合。

在最佳优化条件下，即发酵时间60 h、温度40℃、接种量3%、pH值6的条件下的植物乳杆菌生物量为92.28×106cfu/ml（见表12），此外粗蛋白含量比发酵前上升6.43%，粗纤维含量减小10.22%，乳酸含量成几何倍数增加，钙含量上升64%，磷含量上升28.57%。

2.4 混菌发酵对果蔬液体发酵饲料营养价值的影响

表13 混菌发酵前后果蔬液体发酵饲料营养价值对比

经好氧厌氧混菌发酵后，果蔬液体饲料的营养价值比发酵前有了明显的提高（见表13），其中发酵后粗蛋白含量达到19.88%，比发酵前提高9.2%，比单个菌种发酵的粗蛋白含量最大值高；粗纤维含量比发酵前降低，含量达到2.01%；此外乳酸、生物量、Ca、P也有明显的提升，分别提高至 61.88 g/l、162.73×106cfu/ml、0.99%和0.91%。

3 讨论

3.1 发酵时间是影响液体发酵饲料粗蛋白含量的主要条件，发酵时间过短不利于微生物的生长繁殖，直接影响微生物的产量，从而影响饲料粗蛋白的含量，时间过长则容易将已降解的氨基酸和小肽降解为氨挥发掉，致使饲料粗蛋白降低。所以试验所用的三种菌种发酵时间控制在60 h时效果最佳。发酵时温度对果蔬浓浆液体饲料也有重要影响，温度适中时，繁殖出微生物有利于保证发酵品质，所以酵母菌和枯草芽孢杆菌发酵温度应控制在30℃，而植物乳杆菌发酵温度则应控制在40℃。此外，接种量对生物量也有部分影响，接种量少，发酵液体饲料中有益菌浓度低，则杂菌会利用饲料中营养物质加速繁殖；接种量过多则会造成竞争底物，不利于有益菌生殖。所以酵母菌接种量为2.5%，枯草芽孢杆菌接种量为4%，植物乳酸菌接种量为3%。pH值对发酵果蔬浓浆液饲料的影响主要体现的在乳酸产量上，吴胜华等用酵母菌发酵普通生豆粕时，通过正交试验得到最佳发酵条件中自然pH值、情况下豆粕中小肽含量提高了4.3倍。

3.2 经3种不同的菌种发酵后，果蔬浓浆液饲料的营养价值有了明显的提高，主要是由于发酵中产生了多种消化酶，如枯草芽孢杆菌可产生蛋白酶、纤维素酶、果胶酶，可以破坏细胞壁成分，使营养物质释放出来；酵母菌则可合成菌体蛋白，提高饲料中蛋白质含量；植物乳杆菌则可将糖分转化成乳酸，提高果蔬浓浆液中乳酸含量，均大大提高了饲料的营养价值。

3.3 经3种不同的菌种混菌发酵后，果蔬浓浆液饲料的营养价值比单菌发酵更有所提高，主要是由于菌种产生的多种消化酶共同作用的结果，比单一菌种发酵营养价值提升更加明显。

4 结论

4.1 本试验通过正交试验获得了不同菌种发酵果蔬浓浆液体饲料的最佳优化条件，其中酵母菌最佳优化条件为发酵时间60 h、温度30℃、pH值6.0、接种量3%；枯草芽孢杆菌最佳优化条件为温度30℃、发酵时间60 h、pH值5、接种量4%；植物乳杆菌最佳优化条件为发酵时间60 h、温度40℃、接种量3%、pH值6。在各菌种最佳优化条件下果蔬液体饲料发酵效果最好。

4.2 最佳优化条件下，对各菌种发酵的果蔬液体饲料营养价值均有所提高，经酵母菌发酵果蔬浓浆液饲料，粗蛋白含量比发酵前上升6.59%，粗纤维含量减小20.83%，乳酸含量增加约7.38倍，钙、磷含量也有不同程度的增加。经枯草芽孢杆菌发酵后，粗蛋白含量比发酵前上升8.24%，粗纤维含量减小12.5%，乳酸含量成几何倍数增加，钙、磷含量同样也有不同程度的增加。经植物乳杆菌发酵后，粗蛋白含量比发酵前上升6.43%，粗纤维含量减小10.22%，乳酸含量成几何倍数增加，钙含量上升64%，磷含量上升28.57%。

4.3 将上述3种菌按最佳发酵条件混菌发酵后，饲料营养价值比单一菌种发酵的营养价值有所提高，粗蛋白含量比发酵前上升9.2%，达到19.88%；粗纤维含量降低至2.01%；乳酸、生物量、Ca、P也有明显的提升，分别提高至61.88 g/l、162.73×106cfu/ml、0.99%和0.91%。