高压脉冲电场提取120℃压榨紫苏饼粕蛋白工艺研究

■ 冷进松 朱 珠 孙国玉 刘长虹

(1.吉林工商学院食品工程学院，吉林长春130062；2.粮油食品深加工吉林省高校重点实验室，吉林长春130062；3.河南工业大学粮油食品学院，河南郑州450001)

紫苏（Perilla frutescens）作为我国传统的药食两用植物，也是国家卫生部首批颁布的既是食品又是药品的60种中药之一。紫苏籽是紫苏成熟的果实，含有丰富的紫苏油和蛋白质，其蛋白质含量约为20%～25%。浸出法提油后的紫苏饼粕蛋白质含量更为丰富，高达28%～45%，其氨基酸组成较全面，种类多达18种，并含有人体所必需的8种氨基酸，具有气味芳香，适口性好，杂质少的特点。紫苏饼粕不存在对人体健康有害的物质，是很好的植物蛋白资源。随着紫苏大面积种植和紫苏油开发利用而产生大量的紫苏饼粕副产物只是作为动物饲料、燃料或回入田中充当肥料，没有得到充分合理的利用，并且在一定程度上还可能造成环境污染。因此，有效利用紫苏饼粕资源，研究开发蛋白新产品十分必要。高压脉冲电场(PEF)辅助提取天然成分是近几年发展起来的一种非热提取技术，其原理是高压脉冲电场可以在很短时间内使细胞壁和细胞膜电位混乱，改变其通透性，并可以击破细胞壁和细胞膜，使细胞组分流出，从而有助于对天然成分的提取。此方法提取温度低，因此被提取物的分子结构不易被破坏，而且省时、高效、低能耗。本文采用高压脉冲辅助碱溶酸沉法，通过在不同电场强度、脉冲频率、料液比、碱提温度、碱提时间、碱提pH值的条件下提取紫苏饼粕蛋白工艺的研究，为紫苏蛋白资源的开发利用提供理论指导和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

压榨紫苏饼粕(吉林沃达食品有限公司)；牛血清蛋白、浓盐酸、氢氧化钠、硫酸铜、浓硫酸、四氯化碳、酒石酸钾、甲基红(市售分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)。

1.2 仪器与设备

AY120型岛津托盘电子分析天平(日本岛津制作所)；Sigma 1-14K高速冷冻离心机(德国SIGMA公司)；IKA A11小型冷冻粉碎机(德国IKA集团)；101A-3型电热鼓风干燥箱(上海实验仪器厂)；EG823MF4-NR1型微波炉(美的集团股份有限公司)；FW-80万能粉碎机(上海仕元科学器材有限公司)；22PC可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；HH-S恒温水浴锅(江苏省金坛市环宇科学仪器厂)；SHB-3循环水多用真空泵(广州市深华生物技术有限公司)；PHS-802酸度计(北京华瑞博远科技发展有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 工艺流程

脱脂紫苏粕→加水搅拌→微波处理→NaOH溶液调节pH值→搅拌→离心分离→蛋白质溶液→盐酸调节至等电点→离心分离→干燥→紫苏蛋白。

1.3.2 可溶性蛋白质的测定

1.3.2.1 双缩脲试剂的配制

取1.5 g硫酸铜和6.0 g酒石酸钾钠溶于500 ml蒸馏水中,加入300 ml的10%NaOH溶液并搅拌,用蒸馏水定容至1 000 ml即可,此试剂可长期保存。

1.3.2.2 标准曲线的绘制

牛血清白蛋白(BSA)用0.9%NaCl溶液配制成10 mg/ml标准蛋白溶液。取6只10 ml试管并编号,分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml牛血清白蛋白标准溶液,用蒸馏水补足至1.0 ml,然后各加入双缩脲试剂4.0 ml,旋涡混合器混匀1 min,在室温下放置30 min,于540 nm处,以蒸馏水作参比,进行比色测定,以牛血清白蛋白浓度(mg/ml)为横坐标(X),吸光度A为纵坐标(Y)绘制浓度-吸光度标准曲线如图1所示。

图1 牛血清白蛋白标准曲线

1.3.2.3 样液测定

取样品溶液1.0 ml置容量瓶内,加入1.0 ml CCl4,加入双缩脲试剂3.0 ml,旋涡混合器混匀1 min,在室温下放置30 min后,4 000 r/min离心10 min,取上清液于540 nm处,以蒸馏水作参比,进行比色测定,对照标准曲线方程求得样品溶液蛋白质的浓度。

1.3.3 实验设计

1.3.3.1 单因素实验

采用单次单因素法，假定各因素不存在交互作用，当其它因素保持不变，只改变其中1个因素，然后逐个进行考察分析。

1.3.3.2 Plackett-Burman实验设计

在单因素实验基础上，对电场强度（kV/cm）、脉冲频率(Hz)、料液比、碱提温度(℃)、碱提时间(min)、碱提pH值6个因素进行考察，每个因素取低水平“-1”和高水平“l”。另设1个虚拟列，设计实验次数N=12的Plackett-Burman实验，以提取率Y为回应值，Plackett-Burman试验因素及结果见表1。

1.3.3.3 最陡爬坡实验设计

响应面的拟合方程须在紧接邻域内才近似真实情形，在其它区域，拟合方程与被近似的方程毫无相似之处，几乎无意义；因此，找出主要因素后，必须通过使主要因素同时朝向响应值的最大方向变化，逼近最大响应区间，找出峰值，才能建立有效响应面方程。最陡坡法是多因素序贯试验法中的一种方法，它是将多个需要考查的因素组合在一起同时试验，而不是一次只变动一个因素，因而有利于揭露各因素间的交互作用，可沿着试验指标变化最快的方向迅速找到最优条件。这种试验方法在选矿领域的潜在用途是很广泛的。尤其在最佳工艺条件的选择问题上更显示出了它的科学性和实用性。利用Plackett-Burman设计试验，确定以电场强度(x1)、脉冲频率(x2)、料液比(x3)、碱提pH值(x4)4个主要因素为自变量，以提取率(Y)为回应值。

1.3.3.4 Box-Behnken实验设计

根据Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，用来评价指标和因素间的非线性关系，估计一阶、二阶与一阶交互作用项的多项式模式，是一种有效的响应面设计法。利用Design-Expert8.0.5b进行响应面法优化影响紫苏饼粕蛋白粉的4个主要因素：微波时间(x1)、料液比(x2)、碱提温度(x3)、碱提pH值(x4)进行优化组合，考察目标为蛋白质提取率。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman实验结果分析

表1 Plackett-Burman实验设计表及实验结果

利用Minitab对Plackett-Burman实验数据进行分析，结果如表2所示，其标准偏差为1.177 92，预测误差平方和为60.39%，回归方程的系数R2为95.60%；调整后R2为87.90%。

表2 偏回归系数及影响因子的显著性分析

从检验结果可以看出：主效应中，电场强度(x1)、脉冲频率(x2)、料液比(x3)、碱提pH值(x4)4个主要因素效应显著，其P值分别为0.004、0.008、0.021和0.048，均小于0.050，可以作为进一步优化的因素。其他因素对结果影响不大，在进一步研究中，取中间水平，对影响效果不进行分析。

2.2 最陡爬坡实验结果分析

根据Plackett-Burman试验设计试验，确定以电场强度(x1)、脉冲频率(x2)、料液比(x3)、碱提pH值(x4)4个主要因素为自变量，以提取率(Y)为回应值，其因素水平编码与结果见表3。

由表3可知：第3组实验的提取率最高。这说明最优实验在第4组实验附近。故以实验3的条件为响应面实验因素水平的中心点，电场强度(x1)、脉冲频率(x2)、料液比(x3)、碱提pH值分别为30 kV/cm、15 Hz、1∶22、9进行下一步研究。

表3 最陡爬坡实验设计及结果

2.3 Box-Behnken实验结果分析

基于单因素实验设计，对优化工艺条件进行了一系列的实验，在最陡爬坡实验的基础上，根据Box-Benhnken的中心组合试验设计原理。利用Design-Expert8.0.6进行Response Surface Methodology(RSM)响应面法优化影响紫苏饼粕蛋白提取率的四个主要因素：电场强度(x1)、脉冲频率(x2)、料液比(x3)、碱提pH值(x4)进行优化组合。考察目标为提取率，实验因素水平安排以及根据以上水平编码设计实验表格并检测响应值结果见表4。

对表4数据进行二次多元回归拟合，可求出影响因素的一次效应、二次效应以及交互效应的关联方程并可绘制出响应面图。该模型通过二阶经验模型对变量的响应行为进行表征，即：

式中：Y代表响应值，β0、βi、βii分别表示偏移项、线性偏移和二阶偏移系数，βij是交互效应系数，xi是各因素的编码值。对表4试验数据进行多元回归拟合得到感官评分(Y)对编码自变量x1、x2和X3的二次多项式回归方程：

表4 响应面分析方案及结果

表5结果表明，模型是显著的(P＜0.05)，R-Squared=0.692 4，Adj R-Squared=0.384 9，Pred R-Squared=-0.771 6，模型变异系数为10.52%，精密度为4.811，说明模型准确度和精密度都较高，用该模型进行分析和预测是合理的。

表5 回归模型系数及显著性检验

由表5可知，一次项X4显著，由F值和Prob＞F可知，单因素的影响顺序为x1＞x4＞x2＞x3，电场强度＞碱提pH值＞脉冲频率＞料液比；二次项x12、x22、x32高度显著，x42显著。

2.4 回应曲面分析

2.5 最佳条件的确定

图2 两因素交互作用对紫苏饼粕蛋白提取率影响的响应曲面

为了确定最佳工艺配方条件，对回归方程取一阶偏导数等于零解方程组得x1=-0.264 896，x2=0.299 463、x3=-3.833 197，x4=-0.350 252，此时Y=28.756 81%，即紫苏饼粕蛋白提取的最佳工艺参数为电场强度27.351 04 kV/cm、脉冲频率16.497 32 Hz、料液比为1∶14.333 61、碱提pH值为8.649 748。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用最佳提取工艺条件进行紫苏饼粕蛋白粉脱臭加工，考虑到实际操作的便利，将工艺参数修正为：电场强度28 kV/cm、脉冲频率15 Hz、料液比为1∶15、碱提pH值为9。

3 结论

本研究应用Plackett-Burman实验设计方法快速筛选了对紫苏饼粕蛋白提取效果有影响的各个因素，既省时也可同时比较分析各因素之间的交互作用，保证了实验的精确性。并通过最陡爬坡试验以及Box-Behnken中心组合试验，建立了紫苏饼粕蛋白质提取相互作用的二阶多项式回归模型。对回归模型进行统计分析，获得最优化工艺。高压脉冲辅助提取紫苏饼粕蛋白质的最佳工艺条件为：电场强度28 kV/cm、脉冲频率15 Hz、料液比为1∶15、碱提pH值为9。在此条件下，紫苏饼粕蛋白质提取率为27.001 31%。

（参考文献15篇，刊略，需者可函索）