黄芪和板蓝根多糖的抗菌抗病毒作用研究

■周孟清 张慧茹 贾 峰 赵银丽 黄 进 齐仁立 罗 宇

（1.河南工业大学生物工程学院，河南郑州，450001；2.重庆市畜牧科学院动物营养研究所，重庆，402460）

黄芪（Astragalus）为豆科多年生草本植物，性味甘、性温，归脾、肺经,中医古籍大多把它归为补气药,具有补气升阳、益卫固表、利水消肿、托疮生肌之功效。药用黄芪有两种：蒙古黄芪和膜荚黄芪，主要化学成分有多糖类、皂苷类、黄酮类物质及22种氨基酸和14种微量元素，其他成分包括香豆素、苦味素、胆碱、甜菜碱、亚油酸、B-谷甾醇,以及维生素A、E、B1、B2和叶酸等营养物质，其中黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)是主要生物活性成分，机体免疫调节方面和抗肿瘤方面也具有重要的作用[1]。

板蓝根（radix isatidis）是我国的传统中药,始载于《神农本草经》，为常用中药材，具有味苦、性寒、归心等性质。板蓝根分为两种：一种为十字花科植物菘蓝的根，在北方得到广泛使用，习称“北板蓝”。另一种为爵床科植物马蓝的根，在华南地区及西南大部分地区得到广泛使用，习称“南板蓝”。板蓝根具有较强的抗病毒、抗菌消炎、免疫调节、抗内毒素、抗癌等作用。板蓝根的主要有效成分有：板蓝根多糖(radix isatidis polysaccharide,RIPS)、靛玉红、靛蓝等。

黄芪和板蓝根多糖成分对家禽养殖中常见的细菌和病毒是否具有直接的抑杀作用还未见报道，本试验对这两种活性成分直接的抗菌抗病毒能力进行比较，并通过动物试验研究其对鸡免疫系统的具体影响，以利于黄芪和板蓝根多糖类中草药添加剂的开发和应用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

菌种：鸡大肠杆菌和沙门氏菌由本实验室制备保存。新城疫Ⅰ系强毒苗，新城疫Ⅳ系弱毒Lasta疫苗：购于乾元浩生物股份有限公司郑州生物制药厂。采用酶法[2]提取制备黄芪多糖，用水解醇沉法[3]制备板蓝根多糖，两者纯度分别为69.0%和75.5%。SPF受精蛋，购于乾元浩生物股份有限公司，其它试剂均为国产分析纯级。0.5%鸡红细胞自配。SPF雏鸡，96孔反应板。

1.2 试验方法

1.2.1 体外抑菌试验

取内径90 mm的培养皿高压灭菌30 min，在超净操作台上将培养皿依次标号，倒入灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基，放置使其冷却凝固。待培养基表面干燥后，用涂布玻璃棒粘取一滴菌悬液（大肠杆菌或沙门氏菌），均匀涂布在培养基表面。然后用打孔器（内径4 mm）在培养基上打4个小孔，酒精灯上短暂烘烤使培养基底部轻微融化封上孔底，然后向孔内注0.025 ml药液（指黄芪或板蓝根多糖，浓度0.5 mg/ml或1 mg/ml）。把培养皿放入生化培养箱37℃培养18 h后测量培养基上抑菌圈的大小。

1.2.2 鸡胚法抗病毒试验

黄芪多糖（含量60%）、板蓝根多糖（含量45%），分别用灭菌后的生理盐水配成100、500、1 000 μg/ml 3个浓度的溶液，高压灭菌后备用。

选择尿囊液丰富的9～11日龄健康SPF受精鸡胚，37℃、50%湿度条件下孵育，每2 h翻蛋1次。依照药物不同作用模式，试验分为预防，治疗和直接反应3种。

预防试验，即先用药后接新城疫病毒。治疗试验，即先接毒后用药。直接作用试验，即将药液和病毒混合后接种。用注射器取0.1 ml药物溶液接种于鸡胚内37℃作用2 h，然后接种0.1 ml病毒液继续孵育72 h。收集24 h后全部鸡胚的尿囊液，进行血凝试验测定病毒的效价。新城疫病毒效价测定——采用血凝试验。

1.2.3 鸡群攻毒保护法抗病毒试验

按照预防和治疗的不同处理方法，把鸡分为两个处理，同时设立免疫对照和非免疫对照（见表1），这样既能检测药物对疫苗作用的影响，又能研究药物对染毒后的鸡的作用。

表1 攻毒试验分组设计（黄芪多糖和板蓝根多糖浓度为1 mg/ml）

200只1日龄罗曼蛋公鸡预饲，3日龄用新城疫Ⅳ系苗对鸡群进行免疫（预留50只不免疫，做对照组），13日龄进行二次免疫，18日龄分组。选取120只健康鸡,按照试验设计随机分为6组,每组20只鸡。

分组当天对各预防组开始给药，采用饮水方式每天每组给药即黄芪多糖和板蓝根多糖300 ml，浓度为1 mg/ml，饮完为止。给药后第7 d进行Ⅰ系强毒苗攻毒，通过喷雾加饮水方式攻毒，确保鸡的致病量。攻毒12 h后开始给治疗组喂药，同样是每天浓度为1 mg/ml的药液300 ml，预防组则继续给药。攻毒后记录鸡的发病和死亡情况,对于死亡的病鸡及时剖检，观察病变情况。

攻毒后第1、3、5日每组随机选取3只鸡抽血，检测新城疫抗体。免疫对照组和未免疫对照组在整个试验过程中不给药。

1.2.4 动物饲养试验

为研究黄芪多糖和板蓝根多糖对鸡的生长性能和免疫功能的影响，试验中把鸡分为免疫处理和未免疫处理。同时在免疫处理的基础上部分给药，处理1：黄芪多糖组，按1 mg/ml浓度，饮水饲喂，进行新城疫疫苗免疫。处理2：板蓝根多糖组，按1 mg/ml浓度，饮水饲喂，进行新城疫疫苗免疫。处理3：免疫对照组，进行新城疫疫苗免疫，但不给药。处理4：基础对照组，不免疫，不给药。

取200只1日龄罗曼蛋公鸡预饲。3日龄用新城疫Ⅳ系苗对鸡进行免疫。12日龄时对鸡进行分组。取120只健康鸡,随机分为4个处理,每个处理3个重复，每个重复10只鸡。分组当天开始给药。早上先断水2 h，然后通过饮水喂黄芪多糖、板蓝根多糖（温水助溶，药物浓度1 mg/ml），每天每个处理给药300 ml，饮完为止。分组后第0、5、10、15 d，分别对鸡称重一次，计算日增重。然后每个组随机抽取3只鸡心脏取血，测定新城疫抗体水平。试验第20 d时每个组取5只鸡采血后处死，摘取脾脏，法氏囊，胸腺称重，计算免疫器官指数。

试验日粮主要由玉米，豆粕，鱼粉，次粉，石粉，碳酸氢钙和预混料组成。粗蛋白≥16%、粗纤维≤6%、粗灰分≤10%、Ca 0.8%～1.3%、P≥0.55%、食盐0.3%～0.8%、蛋氨酸≥0.28%、水分≤14%。

免疫器官指数：32日龄时每组取8只鸡采血后处死，摘取脾脏，法氏囊，胸腺称重，计算免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量/鸡体重。新城疫抗体水平测定用微量血凝抑制法（HI），T细胞转化率：采用ANAE法测定T-淋巴细胞比率。肥大细胞计数：参考Ginsburg等[4]的方法进行。

1.3 数据处理

试验结果用“平均数±标准差,或平均数”表示。数据采用SPSS18.0软件进行单因素方差分析和T检验，P＜0.05表示差异显著；P＜0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 两种多糖成分抑菌能力的比较

采用两种有效成分进行体外抑菌试验，试验结果见表2。

表2 两种多糖成分对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制效果

通过表2结果可以看出，0.5 mg/ml和1.0 mg/ml两种浓度的黄芪多糖对大肠杆菌和沙门氏菌均没有直接的抑制能力。板蓝根多糖在低浓度（0.5 mg/ml）时没有明显的抑菌能力，在高浓度（1.0 mg/ml）时则较弱的抑菌能力，对两种菌的抑制作用无明显区别。

2.2 两种多糖成分抗病毒能力的比较（见表3）

表3 两种多糖成分鸡胚法抗病毒结果

以两种多糖成分与新城疫病毒作用后，测定经鸡胚培养后的病毒效价评价病毒的抑杀作用。

由表3可见，当药物浓度升高时，两种药物均表现出明显的抗病毒的效果。黄芪多糖和板蓝根多糖在直接与病毒混合作用时有一定的抑制作用。3种不同的药物作用方式中，药物和病毒直接作用的效果最好，而治疗处理（先接毒后给药）的效果最差。

2.3 体内抗病毒试验的比较（见表4）

表4 攻毒后各组鸡新城疫抗体水平变化

由表4可知，在攻毒后各处理的鸡的HI抗体水平都发生了显著的变化。H组未免疫，抗体水平为0。攻毒后第1 d，预防处理的各组的鸡抗体普遍高于治疗处理各组。攻毒第3 d，所有处理的鸡的HI抗体水平都出现明显下降，这与发病状况吻合。经过持续给药，各处理的鸡的抗体水平均有提高，说明药物在鸡的体内发挥了作用，起到一定的保护效应。

表5 不同药物成分对鸡攻毒保护率的影响

由表5可知，新城疫病毒对未免疫处理的鸡的伤害严重，多数都明显发病，发病率达到85%，且病症较重，尤其是在攻毒后第2 d到第3 d，连续出现病死鸡，病死率达到60%。这也再次说明新城疫是一种烈性传染病，一旦发病，传播非常迅速且大量致死。而对于免疫对照组，鸡的发病率和死亡率都显著的低于未免疫处理，这证明了早期免疫对于预防新城疫是有效的。

而药物处理组，无论是预防处理还是治疗处理，都能够进一步的降低鸡群的发病率和死亡率。在攻毒后各组虽然也普遍发生精神委靡，食欲下降等不良反应，但病症轻微，如果严格判断，发病率低于30%，且经过持续给药，大部分鸡都能在3 d内彻底好转。特别是在预防处理各组中，鸡的病死数很少。黄芪多糖组无病死鸡。这些结果说明中药成分具有一定的增强免疫的效果，能够提高免疫成功率和保护率。

2.4 两种多糖成分对鸡生长性能和免疫功能的影响

表6 黄芪多糖和板蓝根多糖对鸡生长性能的影响

表6结果表明黄芪多糖和板蓝根多糖均使试验组鸡的生长性能有一定的提高，黄芪多糖和板蓝根多糖分别使处理组鸡的日均增重比免疫对照组提高了10.53%和9.21%，比基础对照组分别提高了20.00%和18.57%，但差异不显著（P＞0.05）。

由图1可知，黄芪多糖和板蓝根多糖对鸡HI抗体水平具有不同的影响。免疫后各组的抗体水平都显著高于基础对照组（P＜0.01），说明疫苗免疫对新城疫病毒感染有抵抗作用，而黄芪多糖和板蓝根多糖能在免疫基础上加强保护作用。但与免疫对照组相比时，只有22、27日龄时黄芪多糖使HI抗体提高1.26和1.75个滴度，影响显著（P＜0.05）。

图1 黄芪多糖和板蓝根多糖对鸡HI抗体水平的影响

表7显示两种多糖对鸡体内T细胞转化率具有不同程度的影响。与基础对照组和免疫对照组相比，黄芪多糖能极显著促进T细胞的转化(P＜0.01)，板蓝根多糖处理组使鸡体内T细胞转化率显著升高(P＜0.05)。这些结果说明两种药物成分对T细胞及其所参与的细胞免疫反应均有一定的促进作用。

表7 两种药物成分对免疫系统影响

T细胞通过其表达的受体可以识别机体内衰老、死亡、突变或被病毒感染的细胞，并在刺激分子的协同作用下，直接对靶细胞产生免疫效应[4]。T细胞的转化程度反映了细胞的应答功能。

肥大细胞是机体内一种重要的免疫细胞，能够分泌多种活性物质，在许多生理和病理过程中起重要作用[5]。由表7可以看到，与基础对照组相比，板蓝根多糖使肥大细胞数目极显著（P＜0.01）增加，而黄芪多糖虽然也使其有所增加但差异不显著（P＞0.05）。

法氏囊指数是法氏囊生长发育程度的一个指标，脾脏和胸腺指数也不同程度反映了机体免疫器官发育的水平。试验结果表明：与基础对照组相比，黄芪多糖组的脾脏指数极显著升高(P＜0.01)，而板蓝根多糖组的脾脏指数无显著变化(P＞0.05)。与基础对照组相比，黄芪多糖组的法氏囊指数显著升高(P＜0.05)，而板蓝根多糖组的法氏囊指数极显著降低(P＜0.01)。与基础对照组相比，黄芪多糖组胸腺指数显著提高(P＜0.05)，而板蓝根多糖组极显著提高(P＜0.01)。

3 讨论

黄芪和板蓝根都是常见的中草药，在我国具有长期使用积累的经验，长久以来被广泛用于增强免疫和治病中。这些药物的活性物质具有不同的性状和功效，进入动物机体能够刺激信号因子产生免疫和应答，或能够抑制病原体的增殖和发育，关于中草药具体作用机制尚需进一步研究。

植物多糖可通过提高机体特异性免疫来促进动物抵抗病原体感染，而本试验的结果表明黄芪多糖和板蓝根多糖对细菌生长的直接抑制能力较差，一种可能是本实验中未考虑pH值因数；而李瑜[6]报道对于细菌黄芪多糖0.02 mg/ml时效果最佳；对于霉菌黄芪多糖0.02 mg/ml时效果最佳；当黄芪多糖在pH值为6的条件下，抑菌活性均最强。黄芪多糖对细菌、霉菌都有一定的抑制效果，pH值可影响枸黄芪多糖的抑菌效果。另一可能原因是由于提取方法不同得到的多糖成分不同，本实验采用酶法提取黄芪多糖，而据方圣鼎[7]报道从内蒙黄芪根的水提液中分得三种多糖：黄芪多糖I是杂多糖，由D—葡萄糖、D—半乳糖和L-阿拉伯搪组成；黄芪多糖Ⅱ及Ⅲ，均为D—葡聚糖，其平均分子量分别约为12 300和34 000，由水提法得到的多糖部主要由黄茂多糖I及Ⅱ组成,在小鼠上具有广泛的各种免疫作用,能增加小鼠脾脏的重量及细胞数,增加小鼠脾脏对绵羊红细胞的免疫应答反应和促进腹腔巨噬细胞的吞噬功能。若将黄茂多糖I及Ⅱ分别试验,初步结果表明多糖I能增加脾脏重量及细胞数,但抑制脾细胞对绵羊红细胞的免疫应答反应,多糖Ⅱ作用与多糖I相似，但较弱，而多糖Ⅲ则没有作用。Fu[8]通过核磁共振和荧光光谱分析表明黄芪多糖具有线性结构，由1，3-β-d-半乳糖残基，β-Glc，1,6-α -半乳糖，1,5-β-木聚糖,1,4-β-半乳糖,β-d-半乳糖，1,2-α-Rha，1,2,4-α-Rha残基，C-2 与 C-6 主要以氢键相连。

而不同工艺生产的黄芪多糖对鸡免疫细胞功能的影响有很大差异[9]。本试验鸡胚法检测两种多糖抗病毒的结果显示，随着浓度的升高，二种多糖成分对新城疫病毒的抵抗力明显增强，且多糖与病毒的作用方式对其抗病毒效果影响很大，在这些多糖直接与病毒接触反应能取得较好的抗病毒效果。当病毒感染鸡胚后再给多糖，则治疗效果明显下降。黄芪多糖对H9N2禽流感病毒的复制有抑制作用，可以促进雏鸡的体液免疫反应[10]。

陆林雁[11]发现黄芪多糖注射液能增强庆大霉素对肠炎型细小病毒病的药效，可能的机理是黄芪多糖具有促进机体诱导产生干扰素的能力，一定程度地抑制了病毒的繁殖，同时黄芪多糖在动物体内没有药物残留，减轻了长期用药的毒副作用。钟华[12]研究结果表明黄芪多糖单独使用时对猪细小病毒（PPV）无明显的抑制作用；板蓝根多糖单独使用时，对PPV有明显的抑制作用，APS与IRPS等体积合并时，对PPV的抑制作用显著增强，最小直接杀灭浓度提高为0.29 mg/ml，最小阻断浓度提高为0.070 mg/ml。李丽娅[13]采用黄芪多糖溶液100 g/l浓度,经小白鼠滴鼻给药,对小白鼠肺炎实变有明显的抑制作用，200 g/l、100 g/l浓度组能抑制流感病毒增殖(与病毒对照组比较P＜0.05或P＜0.01)，200 g/l浓度组能延长流感病毒感染小鼠的生存时间,表明黄芪多糖有明显的抗流感作用。另有研究发现黄芪多糖对猪繁殖与呼吸道病毒(PRRSV)和猪流感病毒(CSFV)有免疫抵抗作用。

在本试验中发现，板蓝根多糖和黄芪多糖不同程度的促进鸡免疫系统T细胞转化，增加机体内肥大细胞数目，促进免疫器官的发育，促进动物综合免疫力的提升，从而达到协助机体抵抗病原体感染的疗效。张红英等[14]的试验结果表明,板蓝根多糖能显著促进猪脾脏淋巴细胞的增殖,同时又能协同ConA或LPS诱导的猪脾脏淋巴细胞增殖(P＜0.05)；能显著促进由ConA诱导的猪脾脏淋巴细胞分泌IFN-γ,抑制IL-2的分泌,对IL-4分泌的影响不明显；低剂量板蓝根多糖能显著促进NO的分泌(P＜0.01)。刘俊玲[15]发现板蓝根多糖能引起鸡脾脏淋巴细胞蛋白激酶c活性明显升高。Du等[16]发现一种新的板蓝根多糖具有治疗肺部炎症的潜力。

赵云焕等[17]发现益生菌、黄芪多糖联合处理均能显著提高固始鸡雏鸡周增重、法式囊指数、脾脏指数和血清新城疫抗体效价。刘俊玲等[18]研究扶正解毒散处方，其主要成分是黄芪、板蓝根、淫羊藿,从其中提取植物多糖成分,制作成注射剂用于病毒病的治疗，发现复合多糖注射剂对鸡脾脏淋巴细胞的增殖作用最明显,增殖率为130.42%；对IBDV和NDV均有直接杀灭作用,能够有效的阻断和抑制IBDV和NDV对体外培养CEF细胞的感染。郭新华等[19]研究板蓝根多糖对14日龄蛋公鸡新城疫HI抗体滴度、脾脏、胸腺、法氏囊免疫器官指数的作用，结果显示大多数试验组鸡的抗体滴度与免疫器官指数都显著高于空白对照组,而且低剂量组高于高剂量组。

由于鸡新城疫发病普遍，控制其发生意义很大，新城疫HI抗体是反映鸡新城疫免疫状态的指标，也是反映鸡的特异性体液免疫反应的指标[20]，且简单易测，结果相对比较准确，因此本实验以HI抗体作为评价三种中药活性成分免疫调节作用的一个指标。已有许多报道相关中药或相关成分能增加鸡新城疫抗体水平，注射黄芪多糖有显著的免疫增强作用，能显著逆转环磷酰胺导致的新城疫HI抗体水平下降[21]。郭新华[19]试验发现板蓝根多糖能显著增强HI抗体水平，且低剂量组效果好于高计量组。

本试验中黄芪多糖能显著提高HI抗体水平，而另外两种药物并无影响，尤其是板蓝根多糖之前多人报道有增强HI抗体水平的作用，这可能与给药方式，和药物纯度和含量有很大关系，口服给药可能会降低药物的功效。

黄芪多糖具有调节血糖[22]、保护心血管系统、改善心肌血性损伤的作用。叶红英[23]观察黄芪多糖对STZ糖尿病大鼠物质代谢和心脏机械功能的作用，发现其具有改善糖尿病糖脂代谢和心脏收缩功能,为黄芪多糖的临床应用奠定基础。黄芪多糖APS(100～1 600 mg/ml)可以显著的促进肌管中葡萄糖的摄入，且有时间和剂量效应[24]。黄芪多糖APS能通过激活AMPK途径有效的改善棕榈酸盐诱导的炎症性反应[25]。

临床前试验表明,黄芪多糖有提高荷瘤小鼠T、B淋巴细胞增殖反应,促进脾细胞产生IL-2恢复至正常水平,提高细胞免疫功能,抗肿瘤的作用[26]。唐雪明等[27]发现黄芪多糖对21、35日龄雏鸡T淋巴细胞转化功能有增强作用,且与剂量有相关性,而对7、49日龄雏鸡的作用不明显。胡兴昌[28]实验证明板蓝根凝集素对小鼠胸腺的发育和胸腺细胞的增殖可能具有促进作用,对维持胸腺微环境可能起间接作用。张萍[3]通过自由基清除试验,对板蓝根多糖的活性进行了鉴定,结果显示其具有较强的自由基清除能力。研究发现黄芪多糖的抗萎缩和抗自噬作用，在C2C12骨骼肌肌管和成肌细胞中，黄芪多糖通过Akt,m-TOR,P70s6k,rpS6 and FoxO3A/FoxO1的磷酸化过程可以抑制地塞米松诱导的肌萎缩，通过促进细胞增殖及抑制细胞自噬保护C2C12成肌细胞免受H2O2损害，保护的机理涉及到线粒体途径和死亡受体途经，黄芪多糖具有抗氧化作用可以开发成为保护剂甚至是治疗药物用于肌萎缩症治疗[29]。而硫酸化的黄芪多糖比未硫酸化的黄芪多糖在体外具有更强的抗炎症作用[30]，另外，黄芪多糖脂质体可以显著的提高黄芪多糖药理活性，中高剂量就有最好的作用，黄芪多糖脂质体可以开发成一种新的制剂[31]

4 小结

综上所述，黄芪多糖和板蓝根多糖活性成分具有一定的体外抑菌、抗病毒作用，且能促进动物免疫机能，其作用的发挥受到多糖提取方法、多糖成分与含量、给药方式和剂量的影响，在实际生产中需要采取适当的工艺提取黄芪多糖和板蓝根多糖，采取适宜的方式添加到饲料中才能取得比较好的生产效果。