间充质干细胞成平滑肌分化治疗应用的研究进展

黄 懿，丁留成综述，卫中庆审校

0 引 言

临床许多疾病如膀胱收缩功能障碍、血管损伤等引起平滑肌组织功能障碍，其治疗手段单一、疗效欠佳。近年来，组织工程作为“再生医学”逐渐进入到此类疾病研究中，干细胞是其广泛研究和利用的一种手段。间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSCs)是干细胞的一种，具有自我更新、多向分化和归巢的能力，在特定的体内外环境下，能够诱导分化成为多种组织细胞，如内皮细胞、平滑肌细胞、心肌细胞等。MSCs强大的增殖分化能力以及其来源广泛、取材容易、扩增能力强、免疫原性低、容易进行自体移植等特点使其逐渐成为治疗人类多种疾病潜在的种子细胞。

迄今为止，MSCs在细胞治疗及组织工程中得到了诸多应用［1-3］，但MSCs移植应用于治疗面临两方面问题:①MSCs移植后在局部组织中定植、存活的效率难以保证;②定向分化效率问题，MSCs具有向多种组织分化的潜能，但在移植组织内，MSCs的生存环境发生改变，移植后能否向我们期望的方向分化。如何提高MSCs移植后在局部病理环境中的耐受性，增加细胞归巢定植数量，现就此方面的相关研究进展作一综述。

1 MSCs在组织中的归巢定植

所谓MSCs归巢，指自体的或者外源性MSCs在多种因素作用下，定向趋化迁移至靶器官的病变或损伤组织。这是MSCs有望应用于临床治疗的重要前提，只有增加MSCs归巢及定植的能力，才能从根本上提高细胞治疗的效率。早期的研究发现，体外培养环境可影响MSCs所表达的趋化因子及其受体，这些趋化因子可能促使了MSCs在体内的迁移和定植［4］。另外，有报道发现通过静脉滴注的方式注入体内，MSCs会趋向那些创伤部位，并在静滴过程中有着修复创伤和调节免疫系统的功能［5］。这些研究表明，MSCs的归巢定植可能与一些细胞因子有关。近些年，有关MSCs迁移运动的机制的研究又有新的发现。

1.1 基质细胞衍生因子(stromal cell-derived factor-1，SDF-1)/CXCR4信号通路 SDF-1即CXCL12，属于趋化因子家族中的CXC亚族。SDF-1及其受体CXCR4组成的CXCL12/CXCR4轴在干细胞的募集和迁移中发挥着重要作用。Kitaori等［6］发现，SDF-1信号传导通路受损会导致MSCs丧失趋向创伤部位的定向迁移运动，可见SDF-1(CXCL12)/CXCR4通路在MSCs的趋化迁移过程中发挥着关键作用。通过对其合成和分泌机制的研究，发现SDF-1的分泌过程受到连接蛋白-43(Cx43)和连接蛋白-45(Cx45)缝隙连接的调控，但合成过程和这些连接蛋白并不相关［7］。随着基因转染技术的兴起，一些有利于细胞归巢运动的基因逐渐得到了关注。相关研究通过Snail基因转染MSCs的方法提高了细胞中CXCR4的表达，观察到MSCs的迁移活性得到明显的增强［8］。同时，Piva 等［9］发现一种称为 Slug 的锌指结构转录因子能在转录过程中控制SDF-1的表达，能有效增加SDF-1在特定部位表达补充。SDF-1/CXCR4通路涉及MSCs的存活、迁移和细胞因子的分泌［10］，是目前此方面研究的热点。

1.2 晚期糖基化产物(advanced glycation products，AGEs)AGEs是一种内源性炎症调节因子，调节MSCs的生理功能。通过相关机制研究发现，AGEs能通过激活活性氧-p13通路，诱导产生诸如CC趋化因子的配体Ccl2、Ccl3、Ccl4和白细胞介素-Ⅱ这些细胞因子，进而抑制MSCs的生长和迁移［11］。同时，AGEs还能促使细胞端粒酶的衰老(端粒酶为造血细胞、干细胞、生殖细胞所特有，可延长细胞端粒，增强细胞增殖能力)，从而影响了MSCs的生存迁移能力［12］。可见，合理地控制体内的糖代谢，在细胞治疗过程中尤为重要。

1.3 RhoA/Rho激酶信号通路 转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是一种对细胞的形态发生、增殖和分化过程起着重要作用的细胞因子，广泛用于细胞培养，可刺激间充质起源细胞的增殖和分化能力。Xu等［13］研究发现，RhoA/Rho激酶信号通路可通过与Smad通路相互作用，刺激TGF-β的分泌，有利于MSCs的定植生存。最近还有研究发现，MSCs向组织缺氧损伤部位定向迁移的趋化运动，也与RhoA激酶的活性密切相关［14］。由此表明，对RhoA/Rho激酶信号通路的适当干预可能有利于MSCs在细胞治疗过程中的迁移和有效增殖。

2 MSCs向平滑肌平滑肌细胞(smooth muscle cells，SMCs)的分化

平滑肌广泛分布在血管、胃肠道、气管以及膀胱等处，其功能损害能引起一系列疾病，如动脉硬化和膀胱逼尿肌收缩无力等，严重影响生活质量。随着组织工程研究的兴起，通过将MSCs向SMCs的分化和补充，有望解决一系列临床难题。

平滑肌细胞可分为收缩细胞和合成细胞，收缩性平滑肌细胞表达着一系列特殊收缩蛋白，合成性平滑肌细胞则表现出更高的增殖活性，且抑制着这些收缩性蛋白。如何将MSCs诱导分化出平滑肌组织的同时又保证其收缩功能，是目前亟待解决的问题。在体外培养过程中，以往使用TGF-β或者血栓素A2将BMSCs向平滑肌进行诱导分化［15-16］。

MSCs完成归巢定植后，如何定向分化成为目标功能性组织，是细胞治疗的又一个关键环节。其中，MSCs的成平滑肌分化目前仍未提出确切的方案，近些年有关MSCs定向分化并增殖成为平滑肌细胞的相关机制研究逐渐成为热点，又不断有新的理论提出。

2.1 全反式维甲酸(All-trans retinoic acid，atRA)atRA又称维A酸，是一种常见的抗肿瘤药。其也在平滑肌发育成熟过程中也发挥着关键作用，可增加肌动蛋白、钙调蛋白、22ka平滑肌细胞特殊蛋白和平滑肌肌球蛋白重链等收缩性蛋白的表达，即促进平滑肌细胞收缩表型的形成。在MSCs的定向分化过程中，添加atRA能促进分化细胞的收缩能力，但同时MSCs的增殖性受到影响［17］。

2.2 TGF-β1和PDGF-BB 平滑肌 α 肌动蛋白、钙调蛋白和SM-MHC分别是平滑肌分化的早期、中期和后期的标记物，常以此检测平滑肌的分化程度。早期的研究证实，TGF-β1在0.1～10 ng/mL的浓度范围内可显著增加钙调蛋白的表达［18］。最近研究发现，TGF-β1在1～5 ng表现出诱导 MSCs向 SMCs分化的能力，在1 ng/mL下表现出最强的诱导能力［19］。人血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF-BB)是一种重要的促有丝分裂因子，时常用于细胞培养中，将TGF-β1和PDGF-BB联合应用，可有效提高MSCs的分化增殖效率［20］。

2.3 Myocardin-MicroRNA-1信号通路 近年来，有研究表明促血管平滑肌细胞分化因子(myocardin)在诱导SMCs的收缩表型的形成过程中发挥着关键作用［21］。Myocardin是一种血清应答因子共激活物，其过度表达可诱导MicroRNA-1的表达，抑制SMCs的增殖能 力［22］。通过 抑 制 myocardin 和MicroRNA-1的表达水平，进而解除了 myocardin-MicroRNA-1信号通路后，可促进平滑肌增殖，更快修复损伤组织。同时，在myocardin与Smad 2基因的协同作用下，myocardin可与 TGF-β联合诱导MSCs向平滑肌分化，效率较高［23］。但如何兼顾MSCs的增殖和分化能力，还有待对于此信号通路的进一步研究。

2.4 胶原蛋白Ⅰ和Ⅳ及非细胞基质 在大多数研究中，我们通常在培养基中添加TGF-β1和PDGF-BB来完成MSCs向SMCs的诱导分化，近期又有研究将胶原蛋白Ⅰ和Ⅳ及来源膀胱的非细胞基质添加入培养基中。结果发现，相比TGF-β1和PDGF-BB能加强细胞分化能力，胶原蛋白Ⅰ和Ⅳ及相关非细胞基质主要作用在于维持MSCs的未分化阶段，增强其增殖再生能力，并未表现出诱导分化的趋向［20］。

2.5 多功能性尿激酶受体(urokinasetype plasrinogen activator receptor，uPAR) 已知uPAR能通过激活细胞内相关信号通路，调控多种组织中细胞的迁移、附着、增殖和分化。最近，Vallabhaneni等［24］发现，缺乏uPAR的MSCs表现出趋化迁移和平滑肌组织修复能力的降低，表明uPAR的表达水平同MSCs的迁移以及定向分化能力密切相关。这表示uPAR可能引导MSCs向损伤部位迁移，并调控着MSCs向功能性SMCs的分化。

2.6 支架材料 MSCs用于平滑肌组织重建往往需要合适的支架材料提供组织生长需要的环境。其中，组织工程膀胱用于临床由来已久，多项研究相继报道了MSCs完成了向膀胱SMCs的分化及膀胱组织损伤的修复和置换［25-26］。配合使用PDGF-BB、TGF-β1和VEGF等细胞生长因子诱导成平滑肌分化。在膀胱SMCs的分化过程中，支架的设计和材料也有着重要的作用，最近也有了新的发现:①有研究通过将hMSCs种植在聚乙烯1，8-辛二醇-柠檬酸弹性薄膜上，发现能在体内更好地支持部分膀胱组织的再生。1，8-辛二醇-柠檬酸弹性薄膜可顺应压力的变化，也适合MSCs贴壁生长的特性，从而为hMSCs向膀胱组织的再生提供一个合适的环境［27］。②还有研究将BMSCs种植在羊膜表面，再将羊膜固定在生物海绵上并移植入大鼠模型中，以此提升BMSCs再生膀胱壁的能力，但结果显示此类方法能促进膀胱壁再生，但未测得明显收缩力，难以保证膀胱功能［28］。此外，膀胱来源的细胞外基质也是重要的支持物质，将MSCs和SMCs一同种植入这些基质中或许可增加组织重建的效率［29］。

3 结 语

MSCs作为来源广泛、分化潜能强大的干细胞，是目前细胞治疗和组织工程的新兴研究热点。临床工作中，我们经常遇到许多因组织器官损伤而出现功能失代偿的疾病，如关节软骨的损伤、心肌梗死、糖尿病膀胱等，MSCs的深入研究给其带来治疗希望。然而，要将MSCs真正应用于临床，目前还需要解决其归巢定植和定向分化等一系列问题。MSCs的迁移过程牵涉到了一系列趋化因子和细胞因子，通过对相应细胞因子的调控提高MSCs的定植和归巢运动，但目前还没有提出简单而有效的解决方法。最近，也不断有新的理论提出，例如成人外周血、新生儿脐带血来源的内皮祖细胞或者脐带静脉内皮细胞，可通过MSCs细胞间的连接及细胞外调解激酶，加强 MSCs的贴壁能力及 SMCs标志基因的表达［30］。另外，利用MSCs的相关应用研究也取得初步进展。Du 等［31］和 Gunetti等［32］将 MSCs应用于动物压力性尿失禁治疗的研究中，MSCs的成肌分化和疗效评价肯定了此类细胞治疗的价值。Chen等［33］在膀胱慢性缺血伴逼尿肌收缩功能障碍的大鼠模型中，注射MSCs配合甲磺酸多沙唑嗪灌胃给药，使移植的干细胞在膀胱组织再生，得到了积极的疗效。如今，MSCs成平滑肌分化的理论众多，但尚未有研究提出明确的指导方案。同时，细胞治疗起步不久，技术相对不完善，如何将MSCs运用到种子细胞的培养并有效分化为功能性组织，以及开发出合适的支架以供植入组织的存活分化，是值得关注的问题。

目前，大量有关MSCs的有利基因的过表达的研究在逐步开展［34-35］，但对于MSCs成平滑肌分化还存有大量的空白，进一步深入研究对平滑肌功能障碍所引起的疾病的临床治疗将产生深远的影响。

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