PPARβ/δ激动剂GW501516对人角质形成细胞增殖、迁移和粘附的影响

胡小平 张 伟 陈办成 陈史宏 王勇强 于 波

·论著·

PPARβ/δ激动剂GW501516对人角质形成细胞增殖、迁移和粘附的影响

胡小平 张 伟 陈办成 陈史宏 王勇强 于 波

目的: 评价过氧化物酶体增殖物激活受体β/δ(PPARβ/δ)的激动剂GW501516对人角质形成细胞(KC)增殖、迁移和粘附的影响。方法: 体外培养正常人KC，采用MTT比色法及体外计数法，观察正常人KC在不同浓度GW501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/m l)作用下，其增殖、迁移及粘附情况。结果: 与对照组比较，GW501516促进KC增殖(P＜0.01)，呈剂量依赖性；GW501516显著促进了KC的迁移(P＜0.001)；细胞粘附性与对照组间无统计学差异(P＞0.05)。结论: GW501516能够促进人KC增殖和迁移，对KC粘附无影响。

过氧化物酶体增殖物激活受体； GW501516； 角质形成细胞； 增殖； 迁移； 粘附

过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator－activated receptors，PPARs)是一类激素核受体超家族成员。现已证实有三种不同的PPARs亚型:PPARα、PPARβ/δ、PPARγ。近年来，对于PPARs和炎症性皮肤病的关系受到了学者们的关注。1而人皮肤角质形成细胞(keratinocytes，KC)中，PPARβ/δ是主要的亚型。研究发现PPARβ/δ在增殖的HaCaT细胞和银屑病皮损中表达明显上升，2提示PPARβ/δ可能和KC增殖具有一定的关系。为进一步了解PPARβ/δ对KC的影响，我们选择PPARβ/δ的激动剂GW501516和KC体外共同培养，研究PPARβ/δ激活后对KC的增殖、迁移和粘附功能作用的影响。

1 材料和方法

1.1 组织标本和材料 15名正常人(19～58岁)健康皮肤来自我院皮肤科和整形外科，均按照知情同意的原则留取组织标本。无血清KC培养基(KSFM，含5μg/mL的庆大霉素)，0.5%dispase分离酶(Gibco，美国)，胎牛血清、0.25%胰酶/EDTA(Peprotech，美国)；GW501516试剂(上海浩天然生物技术有限公司)；MTT；二甲基亚砜(DMSO，Solarbio，美国)；其他试剂及器材:T－75培养瓶(Fluka，UK)、细胞计数板、12孔板、96孔板(Costar，美国)等。

1.2 表皮KC的分离和培养 无菌手术后保存在0.5%dispase分离酶中的正常人皮肤标本在4℃过夜后，无菌操作台中分离表皮和真皮。将分离下的表皮置于0.25%的胰酶中，37℃静置10 min。然后以胎牛血清中止胰酶的活性，轻轻吹打表皮，以200目滤网过滤KC悬液，1000 r/min离心7min。然后，弃上清，加入KSFM，将正常表皮KC种植于T－75培养瓶中，37℃，5%CO2培养、传代，所有的实验均利用2～3代对数生长期的KC。

1.3 MTT法检测GW501516对KC增殖的影响MTT法参照文献，3略加改变。对数生长期KC用胰酶/EDTA消化后重悬于KSFM，以5×104/mL密度种植于96孔板，每孔100μL。放置于培养箱中，细胞铺满孔底部60%～70%后，弃培养基，然后用PBS冲洗两次。加入100μL含有不同浓度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/m L)的基础KSFM中，继续孵育48 h。最后每孔加入2μL用PBS配置的MTT(5mg/ mL)。放置于孵箱中3 h后，弃除培养基，加入100 μL DMSO后置于水平振荡器上振荡，然后置于分光光密度仪570 nm读取吸光度值。每种处理因素均设6复孔，重复3次，结果取平均值，以均数±标准差表示。

1.4 细胞迁移实验检测GW 501516对KC迁移能力的影响 细胞迁移实验参照既往的研究方法，4略加改变。改良Boyden chambers中装入8μm孔径的PVP膜，PVP膜光滑面预先用20μg/mL IV型胶原40℃预孵育24 h并在室温下风干，光面向下。趋化盒的下层每孔加入27μL含有不同浓度GW 501516 (0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)的基础KSFM，上层加入50μL密度为5×104/m L的基础KSFM混悬的HaCaT细胞悬液。放置于培养箱中12 h后，取出PVP膜，小心刮去正面的非迁移性的细胞，保留朝下的光滑面的细胞，4%多聚甲醛固定10 min，2%结晶紫染色5 min后流水冲洗，在光镜400×放大倍数每孔随机取5个视野计数迁移到光滑面的细胞，5个视野计数之和代表每孔的细胞迁移数目。每种处理因素均设3复孔，重复3次，结果取平均值，以均数±标准差表示。

1.5 细胞粘附实验检测GW 501516对正常表皮KC粘附能力的影响 对数生长期KC用胰酶/EDTA消化后用PBS冲洗2次后重悬于基础无血清KC培养基，以1×105/mL密度种植于20μg/mL IV型胶原预包被的96孔板，每孔100μL，同时加入不同浓度GW 501516(0、1、5、10、25、50、100 ng/mL)，在培养箱中继续培养4 h。最后弃培养基，然后用37℃预热的无血清KC培养基轻轻冲洗3次以去除未粘附的细胞，每孔加入20μL用PBS配置的MTT(5 mg/mL)，放置于培养箱中3 h后，加入100μLDMSO后水平振荡器振荡5min后，置于分光光密度仪570 nm读取吸光度。每种处理因素均设6复孔，重复3次，结果取平均值，以均数±标准差表示。

1.6 统计学方法 数据采用¯x±s表示，多组均值间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用配对t检验，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

GW501516呈剂量依耐性的促进KC增殖，50 ng/ mL时达到峰值。GW501516能显著促进KC的迁移，浓度在100 ng/mL时约是对照组的11倍。GW501516对KC粘附作用无影响(P＞0.05)。见表1、图1～3。

图1 GW501516对KC促增殖效应。GW501516呈剂量依耐性的促进KC增殖，50 ng/mL时达到峰值。∗表示在GW501516处理组和未处理组之间具有统计学意义(∗:P＜0.05；∗∗∗:P＜0.001)

图2 GW501516对KC迁移的影响。GW501516能显著促进细胞的迁移。∗∗∗表示在GW501516处理组和未处理组之间有统计学意义(P＜0.001)

图3 GW501516对KC粘附作用的影响

表1 GW501516对正常KC增殖、迁移和黏附的影响

3 讨论

一系列研究发现，PPARs被相应的激动剂活化后，在皮肤和其他器官中可调节重要的细胞功能，这些新的功能支持PPARs和相应激动剂可作为治疗不同皮肤病的潜在靶位。5人皮肤KC中，PPARβ/δ是主要的亚型，已有研究认为PPARβ/δ与表皮分化有关。6尽管内源性PPARβ/δ配体激动剂的本质仍不清楚，但几种化学合成的激动剂如GW 501516已在研究PPARβ/δ生理功能的科学实验中被广泛应用。

在已发表的研究中，PPARβ/δ对表皮的增殖作用存在争议，一些研究认为PPARβ/δ的激活促进了表皮细胞的增殖，7而另一些研究认为其活化后会抑制表皮细胞增殖。8，9近年来，在一些KC增生性疾病中如银屑病皮损中发现PPARβ/δ表达明显增加，2并且小鼠体内实验发现PPARβ/δ活化能够触发银屑病特征性的免疫反应，引起银屑病样皮肤损害。10这些研究似乎更倾向于表明PPARβ/δ的激活具有促进表皮KC增殖作用。Tan等研究发现，PPARβ/δ在皮肤伤口愈合过程中有重要的作用，11表明PPARβ/δ活化促进了表皮细胞的迁移功能。对于这些研究现象的争议，目前的解释认为:细胞中PPARβ/δ活化可能存在双相反应，这种反应主要依赖于炎症信号所诱发的变量情况，即在炎症刺激作用下，PPARβ/δ表现为促进细胞增殖作用，而在非炎症情况下表现为抑制细胞增殖功能。

本研究发现PPARβ/δ在激动剂GW 501516的活化下，对正常KC具有明显的促增殖和迁移作用，而对细胞粘附功能无影响，实验结果支持了PPARβ/δ促增殖和迁移的功能，但炎症刺激理论并不能解释这种正常情况下的PPARβ/δ所产生的促增殖和迁移的效应，但由于实验中使用了外源性激动剂GW501516，可能也说明体外实验的结果并不能真实反映PPARβ/δ在体内时的实际功能，因为需要对PPARβ/δ产生作用的机理进一步深入研究。近期发现了一种新的KC增殖和分化稳态控制路径，即PPARβ/δ凭借调节皮肤成纤维细胞的IL－1信号，12为解释此现象带来了希望。

本研究结果显示，PPARβ/δ促进KC增殖和迁移功能与激动剂GW501516的工作浓度呈剂量依耐性，这说明激动剂的浓度大小影响和调节了PPARβ/δ的促增殖和迁移效应，这可能从另外角度说明正常非炎症情况下，虽然表皮KC细胞中有PPARβ/δ的表达，但由于无激动剂活化，PPARβ/δ不会促进正常的KC细胞增殖和迁移。这也间接支持了炎症状态下PPARβ/δ的促增殖效应。另外，研究结果显示PPARβ/δ对KC的粘附作用无影响，而粘附功能在炎症因子趋化过程中发挥重要作用，这提示PPARβ/δ可能对炎症过程无调节作用。

总之，结合相关研究，13说明PPARβ/δ在调节细胞存活、增殖和迁移以及修复等方面具有重要作用，尤其可能在增殖性炎症性皮肤病发病机制中有重要影响，表明其将来可能成为治疗此类疾病的药物作用靶点。

1 Sertznig P，Reichrath J.Peroxisome proliferator－activated receptors(PPARs)in dermatology:challenge and prom ise.Dermatoendocrinol，2011，3(3):130－135.

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3Weichert H，Blechschmidt I，Schroder S，et al.The MTT assay as a rapid test for cell proliferation and cell killing:application to human peripheral blood lymphocytes(PBL).Allerg Immunol (Leipz)，1991，37(4):139－144.

4 Zhang K，Krammer RH.Laminin 5 deposition promotes keratinocytemotility.Exp Cell Res，1996，227(2):309－322.

5 Villarrubia VG，Vidal－Asensi S，Pérez－Bañasco V，etal.Lipid nutrition and the epidermal barrier:The connection between immune－mediated inflammatory diseases and peroxisome proliferator－activated receptors，a new therapeutic target in psoriasis and atopic dermatitis.Actas Dermosifiliogr，2010，101(7):585－599.

6 Burdick AD，Kim DJ，Peraza MA，et al.The role of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta in epithelial cell growth and differentiation.Cell Signal，2006，18(1):9－20.

7Hao CM，Redha R，Morrow J，et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor deltaactivation promotes cell survival following hypertonic stress.JBiol Chem，2002，277(24):21341－21345.

8 Burdick AD，Bility MT，Girroir EE，et al.Ligand activation of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta(PPARbeta/delta)inhibits cell growth of human N/TERT－1 keratinocytes.Cell Signal，2007，19(6):1163－1171.

9 Borland MG，Foreman JE，Girroir EE，et al.Ligand activation of peroxisome proliferator－activated receptor－beta/delta inhibitscell proliferation in human HaCaT keratinocytes.Mol Pharmacol，2008，74(5):1429－1442.

10 Romanowska M，Reilly L，Palmer CN，et al.Activation of PPARbeta/delta causes a psoriasis－like skin disease in vivo. PLoSOne，2010，5(3):9701.

11 Tan NS，Michalik L，Desvergne B，etal.Genetic－or transforming growth factor－beta 1－induced changes in epidermal peroxisome proliferator－activated receptor beta/delta expression dictate wound repair kinetics.J Biol Chem，2005，280(3): 18163－18170.

12 Chong HC，Tan MJ，Philippe V，et al.Regulation of epithelial－mesenchymal IL－1 signaling by PPARbeta/delta is essential for skin homeostasis and wound healing.JCell Biol，2009，184 (6):817－831.

13 Man MQ，Barish GD，Schmuth M，et al.Deficiency of PPAR-beta/delta in the epidermis results in defective cutaneous permeability barrier homeostasis and increased inflammation.J Invest Dermatol，2008，128(2):370－377.

(收稿:2013－11－17 修回:2014－01－05)

Effects of PPARβ/δagonist GW 501516 on the proliferation，m igration and attachment of human keratinocytes in vitro

HU Xiao-ping，ZHANGWei，CHEN Ban-cheng，etal.Department ofDermatology，Shenzhen Hospital，Peking University，Guangdong，518036

Objective:To investigate the influence of peroxisome proliferator receptorβ/δ(PPARβ/δ)agonist GW501516 on the proliferation，migration and attachment of cultured human keratinocytes(KC).Methods:After the KCs were treated with different concentrations of GW 501516(0，1，5，10，25，50，100 ng/ m l)，the cell proliferation，migration and attachmentweremeasured by MTTmethod.Results:Compared with control group，GW 501516 significantly increased the cell proliferation(P＜0.001)，in a dose－dependentmanner，and markedly promoted the cellmigration(P＜0.001).There was no significant difference in the cell attachmentbetween the experimental group and control group(P＞0.05).Conclusion:The results demonstrate that GW501516 can stimulate human KC proliferation andmigaration，but has no effect on KC attachment.

peroxisome proliferator receptor；GW 501516；human keratinocytes；proliferation；migration；attachment

广东省自然科学基金项目(编号:S2012040006694)

广东省医学科研基金项目(编号:B2012329)

深圳市科技计划项目(编号:201203035)

北京大学深圳医院皮肤科，广东深圳，518036