响应曲面法优化裂褶菌多糖的微波辅助提取工艺研究

张虽栓，李延磊，高诚伟

(1.河南质量工程职业学院，河南 平顶山 467000； 2.云南大学化学科学与工程学院,云南 昆明 650091)

褶菌多糖(Schizophyllan)是菌体经发酵培养的中性胞外多糖.裂褶菌多糖的结构与分子量的高低与裂褶菌菌种的选择、培养和发酵条件的有关，而多糖的分子量又直接影响了多糖的生物学活性和开发前景，在调节免疫功能、抗肿瘤、抗辐射等方面有显著的疗效[1、2]，特别是相对分子量在450kD以上的多糖在医药领域的应用最为广泛，需求量最大[3、4].目前，对裂褶菌多糖提取工艺的研究主要有酸提取法、热水浸提法和稀碱提取法等[5～8].微波辐射辅助提取法具有选择性高、提取时间短、提取率高等优点.本研究将微波技术用于高分子量裂褶菌多糖的提取，组合提取工艺，以期达到提高提取率、减少能耗的目的.

1 材料与方法

1.1材料与试剂

裂褶菌(SchizophyllumcommuneFr.)种由昆明云覃科技开发有限公司提供.

1.2仪器与设备

普通恒温摇床,中国科学院武汉科学仪器厂；HZQ-F280全温度振荡培养箱，太仓市华美生化仪器厂；UV-2102PC紫外可见分光光度计，德国Bruker公司；2K-82A型真空干燥箱，上海市实验仪器总厂； 320-S型pH计，METTLER TOLED; AEl00S电子分析天平; Galanz WD700ATL17-3电脑型烧烤微波炉(功率计为700 W).

1.3试验方法

1. 3.1 培养条件 菌种采用PDA固体培养基，将菌种接种到试管斜面培养基上，于室温静置活化3 d，活化好的斜面菌种接入装有50 mL种子培养基的三角瓶中27 ℃下培养2 d，得到液体菌种；接着将菌种接种到固体培养基27 ℃下培养7～8 d，至菌丝体充满整个培养基，结束发酵过程[9、10].

1.3.2 纯度鉴定

1.3.2.1 凝胶柱层析 将Sephadex G-100装于1.6 cm×20 cm玻璃旋塞柱并平衡，SPG上样量1 mg，用双蒸水洗脱，每管收集3 mL，流速0.5 mL·min-1.采用硫酸-苯酚法[11]在490 nm处隔管检测OD值.

1.3.4 微波提取裂褶菌多糖的提取工艺流程 斜面种子培养—液体菌种接种—固体发酵培养—干燥—粉碎—微波提取—乙醇沉淀—粗裂褶菌胞外多糖含量测定—粗多糖纯化(脱色、脱蛋白)—成品.

1.3.5 裂褶菌多糖得率的测定 裂褶菌多糖含量的测定采用水浸-醇沉法提取测定法，经适当稀释后用苯酚-硫酸法测定溶液中多糖含量.裂褶菌多糖提取率计算公式[12]为：

多糖提取率=所得溶液中粗糖含量(mg/mL)×多糖溶液体积(mL)×释释倍数×换算因子/原材料质量(mg)×100%

1.4裂褶菌多糖微波提取工艺优化

1.4.1 单因素试验 选取微波强度、提取温度、料液比、提取时间4个因素作单因素试验[13].取一定量粉碎的裂褶菌干体，利用微波在微波强度为450～650 W之间，加入料液比(质量与体积比)1∶10～1∶35 g·mL-1的蒸馏水， 10～60 ℃的温度下对裂褶菌多糖进行了5～30 min进行提取，探讨其对裂褶菌多糖提取率的影响.

1.4.2 响应面优化提取条件 根据单因素试验结果，确定了最佳条件后，以Box-Benhnken中心组合试验设计原理进行试验，设计了4因素5水平组合试验优化裂褶菌多糖的提取工艺[14].

表1 响应面分析因素与水平

2 结果与分析

2.1微波提取裂褶菌多糖工艺的优化

2.1.1 微波强度对裂褶菌多糖提取率的影响 微波强度对裂褶菌多糖提取率的影响见图1.从图1可以看出，在提取时问为30 min，液料比为1∶30 g·mL-1，提取温度为50 ℃的条件下,随着微波功率的逐渐提高，裂褶菌多糖提取率不断增加[15].当微波功率达到550 W时，达最大值.再随功率的增加，多糖提取率变化不明显，所以选取550 W为最佳功率.

2.1.2 微波提取时间对裂褶菌多糖提取率的影响 提取时间对裂褶菌多糖提取率的影响见图2.由图2可知，在10～20 min裂褶菌多糖质量分数增加的最快， 在20 min以后裂褶菌多糖的质量分数有所增加，但趋势很慢.根据提取理论可知，提取时间延长有利于提取得率的提高，但是要考虑实际因素，使成本最低时相对得率最大.综合提取过程中的每个因素，从节约能源，降低成本考虑20 min为最佳提取时间.由图2可知，随着微波提取时间的增加，裂褶菌多糖的提取率呈上升趋势.当时间达到20 min时，多糖提取率达到最大，所以选取20 min为佳.

图1 微波强度对裂褶菌多糖提取率的影响

图2 提取时间对裂褶菌多糖质量分数的影响

2.1.3 不同料液比对裂褶菌多糖提取率的影响 不同料液比对裂褶菌多糖提取率的影响见图3.由图3可知，多糖提取率随料液比增加而上升.经分析料液比从1∶6 g·mL-1增加到1∶30 g·mL-1多糖提取率显著上升，而料液比增加到1∶30 g·mL-1以后提取率变化增加不明显，所以1∶30 g·mL-1为适宜提取料液比.

图3 不同料液比对裂褶菌多糖提取率的影响

2.1.4 提取温度对裂褶菌多糖提取率的影响 提取温度对裂褶菌多糖提取率的影响见图4.由图4可知，裂褶菌多糖的提取率随着温度的升高在逐渐的提高，温度在10～50 ℃时，裂褶菌多糖的提取率增加最快，当温度达到50 ℃时，裂褶菌多糖达到最大，60 ℃时，裂褶菌多糖的提取率则降低，可能是裂褶菌多糖在高温下会发生裂解，导致它的生物活性降低.综合整个过程，从节约能源、降低成本、缩短生产时间考虑，故选择50 ℃为最佳提取温度.

图4 提取温度对裂褶菌多糖提取率的影响

2.2响应面法优化裂褶菌多糖的提取工艺

2.2.1 分析因素的选取 根据Box-Behnken的中心组合试验设计原理[17～19]，结合单因素试验结果，采用响应面试验设计，以裂褶菌多糖的提取率(Y)做4因素5水平响应面试验设计，因素及水平设计如表1，试验设计与结果见表2.

表2 响应面数据分析结果

续表 Continuing table

2.2.2 模型的建立及其显著性检验

2.2.2.1 试验设计及结果 在单因素的基础上，应用Design-Expert 7.0软件对表2试验数据进行拟合分析，，用二次回归旋转组合试验统计方法，综合考虑各个因素对裂褶菌胞外多糖得率的影响，进行多元回归拟合，得到二次多元回归方程：

Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.

2.2.2.2 二次回归模型的显著性检验 对上述回归模型进行方差分析结果表明(表3)，该模型P值小于0.000 1，失拟项P=0.088不显著，表明该模型拟合结果好.由表4可知，除料液比显著影响(P=0.004)，微波强度(P=0.003 8)具有显著影响外，其他因素如二次项和交互项对裂褶菌多糖的提取率都有极显著的影响，数据表明具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系.各个因素对裂褶菌多糖提取率的影响程度大小顺序为：料液比(X2)>微波强度(X4)>提取时间(X1)>提取温度(X3).由相关系数R=0.907，表明该数学模型4个因素对产量的影响占90.7%，而其它因素的影响和误差占9.3%.

表3 回归模型方差分析

表4 回归模型系数显著性检验

2.2.2.3 最佳提取裂褶菌胞外多糖方案 利用回归方程分别对X1，X2，X3，X4求偏阶导数并令其等于零，解方程组既得X1=0，X2=-0.164 1，X3=0.078 5，X4=-0.030 23.即提取裂褶菌多糖的最佳工艺条件是：提取时间为20 min，料液比为1∶28.5 g·mL-1，提取温度为51 ℃，微波强度为548 W.

通过软件分析，当裂褶菌多糖产量最高组合为：X1=20 min；X2=1∶28.5 g·mL-1；X3=51 ℃；X4=548 W，即最佳提取工艺为：提取时间为20 min，料液比为1∶28.5 g·mL-1，提取温度为51 ℃，微波强度为548 W.此条件下，多糖理论提取量为1.78%.为了检验所得结果的可靠性，采用优化条件进行提取试验，实际测得值为1.76%，与理论值相比，0．1%以内的相对误差，因此，响应曲面法所得的优化条件，裂褶菌多糖提取工艺参数准确可靠，具有实用价值.

图5 料液比与提取时间对裂褶菌多糖提取率的影响

图6 微波强度与提取时间对裂褶菌多糖提取率的影响

图7 提取温度与提取时间对裂褶菌多糖提取率的影响

图8 提取温度与料液比对裂褶菌多糖提取率的影响

图9 微波强度与料液比对裂褶菌多糖提取率的影响

图10 微波强度与提取温度对裂褶菌多糖提取率的影响

3 结论

1)通过单因素试验，确定了裂褶菌多糖提取的最经济、最适用的范围，提取时间20 min，料液比为1∶30 g·mL-1，提取温度50 ℃，微波强度550 W.

2)利用Design-Expert 7.0软件响应面法，建立二次回归模型方程：Y=1.89+0.033 1X1+0.013 8X2+0.010 1X3+0.036 5X4-0.074 2X12-0.029 2X22-0.079 6X32-0.055 3X42-0.047 2X1X2+0.005 4X1X3-0.049 7X1X4-0.016 4X2X3-0.018 2X2X4-0.001 0X3X4.回归方程拟合的较好，可以用方程预测裂褶菌多糖的提取工艺参数.

3)通过计算与验证得到裂褶菌多糖的最优提取工艺条件为：提取时间为20 min，料液比为1∶28.5 g·mL-1，提取温度为51 ℃，微波强度为548 W.此条件下，多糖理论提取率为1.78%，实际提取率为1.765%，相对误差为0.1%，预测值与实际值之间拟合性好.

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