四种隐孢子虫半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因的克隆和序列分析

王晓娟，米荣升，周 鹏，黄 燕，王向佩，杨晓娇，石 凯，刘宇轩，雷晓思，陈兆国，赵 权

（1. 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 中国农业科学院动物源性食品安全研究中心，上海 200241）

四种隐孢子虫半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因的克隆和序列分析

王晓娟1,2，米荣升2，周 鹏2，黄 燕2，王向佩1,2，杨晓娇2，石 凯2，刘宇轩2，雷晓思2，陈兆国2，赵 权1

（1. 吉林农业大学动物科学技术学院，长春 130118；2. 中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室 中国农业科学院动物源性食品安全研究中心，上海 200241）

为克隆不同种隐孢子虫（Cryptosporidium spp.）的半胱氨酸蛋白酶Cryptopain-1基因，分析其核苷酸与编码氨基酸序列的变异情况，根据GenBank上公布的微小隐孢子虫（C. parvum）Cryptopain-1基因序列设计合成引物，用PCR技术从不同种隐孢子虫基因组DNA中扩增Cryptopain-1基因，并将其克隆至pZeroBack/blunt载体，阳性克隆经PCR鉴定正确后测序，与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因进行序列同源性比对，并进行系统进化分析。结果显示，本研究成功从泰泽隐孢子虫（C. tyzzeri）、火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）、兔隐孢子虫（C. cuniculus）基因组DNA中扩增出Cryptopain-1基因。与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因比较，泰泽隐孢子虫、火鸡隐孢子虫、兔隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列相似性分别为98.67%、94.53%、98.34%，演绎的氨基酸序列相似性分别为99.00%、96.51%、99.00%。研究结果为利用Cryptopain-1基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究奠定了基础。

隐孢子虫；Cryptopain-1基因；克隆；序列分析

隐孢子虫（Cryptosporidiumspp.）是一种细胞内寄生原虫，它能够感染多种动物和人，引起以腹泻为主要症状的隐孢子虫病（cryptosporidiosis）[1]。隐孢子虫病不仅给畜牧业带来了很大的经济损失，而且对人类健康也有严重威胁。健康人感染隐孢子虫通常表现为自限性腹泻，但是免疫功能不全的人尤其是艾滋病（AIDS）患者感染隐孢子虫会引起长期、严重的腹泻，甚至死亡[2]。尽管近年来隐孢子虫分子生物学研究取得重要进展，但是目前仍然没有一种有效的疫苗或者治疗方法[3]。因此，对隐孢子虫生活史中发挥重要生理功能的靶分子的鉴定就显得尤为重要。

半胱氨酸蛋白酶（cysteine protease，CP）是一类在酶的活性中心含有半胱氨酸残基的蛋白水解酶，生物体内的很多化学反应都需要其催化，它参与生物体多种生理病理过程，备受学者的关注[4]。对人CP的研究主要集中在细胞凋亡和恶性肿瘤两方面，而对于寄生虫CP，主要是研究其在寄生虫免疫逃避、毒力、虫体入侵、脱囊/包囊形成等过程中的作用[5-7]。对顶复门寄生虫CP的研究发现，该酶在疟原虫（Plasmodiumspp.）[8,9]、弓形虫（Toxoplasma gondii）[10-13]、艾美耳球虫（Eimeriaspp.）[14]生活史中有至关重要的作用，包括蛋白加工、宿主细胞入侵、脱囊和营养吸收，但是对隐孢子虫CP的研究甚少。1999年，Petersen和Huang在GenBank上登录了微小隐孢子虫（Cryptosporidium parvum）NINC株CP及其前体序列（登录号：AF091366）；2004年，Abrahamsen等[15]通过对微小隐孢子虫Iowa Ⅱ分离株的全基因组序列进行测定，报道了微小隐孢子虫CP基因序列（GenBank登录号：XM_627814）；2009年，Na等[16]设计引物，以微小隐孢子虫DNA为模板成功扩增了该基因，将其标记为Cryptopain-1基因，并进行了克隆表达，采用免疫荧光技术对其在微小隐孢子虫子孢子上的定位进行了分析，发现Cryptopain-1在微小隐孢子虫子孢子阶段表达，能水解纤维连接蛋白和胶原蛋白，而这些蛋白是宿主细胞外基质和维持细胞完整性的重要成分，从而推测它在隐孢子虫入侵和逸出宿主细胞时可能发挥重要的生物学作用。由于隐孢子虫子孢子对宿主细胞的附着和侵袭是其致病的关键，因此，隐孢子虫CP Cryptopain-1基因有可能成为隐孢子虫病药物治疗的一种新的靶基因。鉴于此，本研究对不同种隐孢子虫CP Cryptopain-1基因进行克隆，对其序列进行比较和系统进化分析，为隐孢子虫代谢、致病及防控研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 虫种和菌株微小隐孢子虫Iowa Ⅱ分离株和泰泽隐孢子虫（C. tyzzeri）由中国农业科学院上海兽医研究所隐孢子虫病防治课题组保存提供，并分别经新生犊牛和ICR小鼠传代保种；火鸡隐孢子虫（C. meleagridis）由中国农业科学院上海兽医研究所黄兵研究员惠赠；兔隐孢子虫（C. cuniculus）分离自上海某实验动物饲养场；大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1购自北京全式金生物技术有限公司。所有种隐孢子虫卵囊经纯化后提取基因组DNA，－20℃保存，并经小亚基核糖体RNA（small subunit rRNA,SSU rRNA）基因序列测定和基于该基因的PCRRFLP技术[17,18]鉴定种类。

1.2 主要试剂KOD DNA聚合酶购自TOYOBO公司；pZeroBack/blunt载体购自天根生化科技（北京）有限公司；T4 DNA 连接酶、DNA Marker购自宝生物工程（大连）有限公司；AxyPrep DNA胶回收试剂盒购自美国康宁公司。

1.3 引物的设计和合成根据GenBank公布的微小隐孢子虫Cryptopain-1基因序列（登录号：DQ156545），利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物，P1：5'-ATGGACATAGGAAACAACGTGGAA GAACAT-3'；P2：5'-TTATATTGATTGATTAATC ACTGGATACAC-3'。引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.4 Cryptopain-1基因的PCR扩增按常规方法进行PCR扩增，在50 μL的反应体系中，加入2×PCRbuffer （含Mg2+） 25 μL，100 μmol/L引物P1、P2各 0.5 μL，2 mmol/L dNTP 8 μL，20 mg/mL BSA 2 μL，1 U/μL KOD酶1 μL，DNA模板2 μL，加灭菌水补至50 μL。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min 30 s，共35个循环；最后在72℃延伸10 min。取5 μL扩增产物进行12 g/L琼脂凝胶电泳鉴定，用凝胶成像仪Image Quant 300（美国GE公司）观察和记录结果。

1.5 目的基因的克隆与鉴定将目的片段进行切胶回收，克隆到pZeroBack/blunt载体中，转化Trans1-T1感受态细胞，挑取单克隆培养，菌液鉴定正确的阳性克隆挑取2个送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。四次测序结果完全一致后确定为该基因序列。

1.6 Cryptopain-1基因序列分析用DNAMAN 7.0软件将获得的不同种隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与 GenBank 登录的微小隐孢子虫序列 （登录号：DQ156545） 进行同源性比较。

1.7 不同种间半胱氨酸蛋白酶基因的进化树分析从GenBank下载微小隐孢子虫（登录号：DQ156545）、人隐孢子虫（C. hominis，登录号：XM_661605）、鼠隐孢子虫（C. muris，登录号：XM_002142683）、柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella，登录号：JN641867）、刚地弓形虫（Toxoplasma gondii，登录号：AY660746）、克氏锥虫（Trypanosoma cruzi，登录号：M90067）、帕氏利什曼原虫（Leishmania pifanoi，登录号：M97695）、恶性疟原虫（Plasmodium falciparumfalcipain-2，登录号：AF239801；Plasmodium falciparumfalcipain-3，登录号：AF282974）、间日疟原虫（Plasmodium vivaxvivapain-2，登录号：AY208270；Plasmodium vivaxvivapain-3，登录号：AY221736）、捻转血矛线虫（Haemonchus contortus，登录号：M80388）、日本血吸虫（Schistosoma japonicum，登录号：U38475）、华支睾吸虫（Clonorchis sinensis，登录号：AB020036）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，登录号：M97910）、鲤鱼（Cyprinuscarpio，登录号：L30111）、小家鼠（Mus musculus，登录号：J02583）、人（Homo sapiens，登录号：M20496）18个物种的CP基因序列，用软件MEGA 5.1以邻接法分析隐孢子虫CP Cryptopain-1基因与其他物种CP基因之间的亲缘关系。

2 结果

2.1 Cryptopain-1基因的PCR扩增经过35个循环的PCR扩增，成功地从微小隐孢子虫Iowa Ⅱ分离株、泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫和火鸡隐孢子虫卵囊基因组DNA中扩增到Cryptopain-1基因，大小均约为1200 bp（图1）。

图1 Cryptopain-1基因PCR扩增产物电泳结果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of Cryptopain-1 gene of different Cryptosporidium species

2.2 Cryptopain-1基因核苷酸序列分析经 DNAMAN 7.0软件分析表明，4种隐孢子虫Cryptopain-1基因大小均为1206 bp，编码401个氨基酸。克隆的微小隐孢子虫Iowa Ⅱ分离株Cryptopain-1基因与GenBank上登录的微小隐孢子虫Cryptopain-1基因序列（登录号：DQ156545）比较，相似性为100%；而泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫、火鸡隐孢子虫与其比较，相似性分别为98.67%、98.34%、94.53%（表1），分别有16、20、66个核苷酸差异（图2）。上述3种隐孢子虫的Cryptopain-1基因序列均已提交到GenBank数据库中，其中泰泽隐孢子虫的登录号为KJ534570、兔隐孢子虫登录号为KJ534571、火鸡隐孢子虫登录号为KJ534572。

图2 4种隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸序列比较Fig.2 Comparison of the nucleotide sequences of Cryptopain-1 gene of four Cryptosporidium species

2.3 Cryptopain-1基因编码的氨基酸序列分析 用DNAMAN 7.0软件将测得的Cryptopain-1基因与已知的微小隐孢子虫相应基因序列翻译成氨基酸序列并进行同源性比较，结果泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫、火鸡隐孢子虫分别有4、4、14个氨基酸差异（图3）。与微小隐孢子虫Cryptopain-1比较，泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫相似性均为99.00%，火鸡隐孢子虫相似性为96.51%（表1）。

表1 4种隐孢子虫Cryptopain-1基因核苷酸和演绎的氨基酸序列相似性比较Table 1 Comparision of Cryptopain-1 gene nucleotide and deduced amino acid sequences between four Cryptosporidium species

图3 4种隐孢子虫Cryptopain-1氨基酸序列比较Fig.3 Comparison of the deduced amino acid sequences of four Cryptosporidium species Cryptopain-1

2.4 不同物种间半胱氨酸蛋白酶基因的进化分析 结果显示，泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫、火鸡隐孢子虫和微小隐孢子虫、人隐孢子虫Cryptopain-1基因在一个聚簇上，亲缘关系最近；其次是恶性疟原虫、间日疟原虫，再次是刚地弓形虫和利什曼原虫，最远的是吸虫和克氏锥虫（图4）。

图4 不同物种间Cryptopain-1基因的系统进化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Cryptopain-1 gene of different species

3 讨论

CP广泛存在于人、动物和寄生虫体内[6]，它作为一种蛋白水解酶，参与机体蛋白水解。研究发现，CP在寄生虫体内发挥着重要生物学功能，包括原虫、蠕虫和节肢动物降解外源性蛋白质[19]及脱包囊/包囊形成、脱鞘和羽化[20,21]等。CP不仅与寄生虫的免疫逃避有关，而且涉及宿主细胞的免疫损伤[9]。因此，它在寄生虫的生存、发育及寄生虫与宿主的相互作用中扮演着十分重要的角色，是在各种寄生虫感染过程中起重要作用的一类关键酶，也越来越受到人们的关注。在其他顶复门寄生虫如疟原虫、弓形虫和球虫生命活动中，CP在感染过程中所起的关键作用也已被广泛报道，包括蛋白加工、宿主细胞入侵、脱囊和营养吸收[10-16]。

Cryptopain-1基因是目前微小隐孢子虫中报道的唯一一种CP基因。分析同一基因在不同种隐孢子虫间的基因突变对于研究其生物学特性具有重要意义。目前公认的隐孢子虫有20多种[22]，它们在宿主特异性和致病性方面存在差异。研究表明，虽然不同种隐孢子虫之间一些已经发现的蛋白核苷酸序列高度保守，但是仍然存在差异。米荣升等[23]对不同动物来源的鼠源、兔源和猪源隐孢子虫子孢子表面抗原CP15基因进行扩增，结果发现该基因同源性为99.23%、97.56%和98.72%。胡义彬等[24]对隐孢子虫鼠基因型、兔基因型和猪基因型的P23基因进行扩增，同源性为97.3%、97.3%和96.4%。本研究成功克隆了微小隐孢子虫、泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的Cryptopain-1基因，得到的微小隐孢子虫基因序列与GenBank登录的序列完全一致，而泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫、火鸡隐孢子虫与微小隐孢子虫Cryptopain-1基因的相似性分别为98.67%、98.34%、94.53%，分别有16、20、66个核苷酸差异；对演绎的氨基酸序列进行比较，发现泰泽隐孢子虫、兔隐孢子虫均有4个氨基酸差异，相似性为99.00%，而火鸡隐孢子虫有14个氨基酸差异，相似性为96.51%。这种差异可能是由隐孢子虫种间基因多态性造成，也可能是发生了基因突变，需要进一步研究。不同物种间的CP进化亲缘关系分析显示，疟原虫与隐孢子虫亲缘关系最近，其次是利什曼原虫和刚地弓形虫，而同属于顶复门寄生虫的柔嫩艾美耳球虫与隐孢子虫亲缘关系较远，这可能是因为CP是一个家族，而GenBank登录的不同物种的CP与隐孢子虫Cryptopain-1都属于该家族但并非同一种蛋白，从而导致他们之间的进化亲缘关系比较复杂。但是从进化亲缘关系分析中仍然可以看出，不同种隐孢子虫Cryptopain-1基因序列高度同源，提示该基因表达产物可能成为一个重要的疫苗候选抗原。

对不同种隐孢子虫CP Cryptopain-1基因的克隆、序列分析和系统进化分析，为利用该基因进行隐孢子虫的代谢、致病机理等研究提供了科研基础；能否通过利用Cryptopain-1的酶抑制剂达到抑制隐孢子虫在体内生存繁殖的目的，从而达到防治隐孢子虫病的作用，尚需进一步研究。

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CLONING AND SEQUENCE ANALYSIS OF CYSTEINE PROTEASE CRYPTOPAIN-1 GENE OF FOUR CRYPTOSPORIDIUM SPECIES

WANG Xiao-juan1,2,MI Rong-sheng2,ZHOU Peng2,HUANG Yan2,WANG Xiang-pei1,2,YANG Xiao-jiao2,SHI Kai2,LIU Yu-xuan2,LEI Xiao-si2,CHEN Zhao-guo2,ZHAO Quan1
(1. College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China; 2. Animal-borne Food Safety Research Center of Chinese Academy of Agricultural Sciences,Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture,Shanghai Veterinary Research Institute,CAAS,Shanghai 200241,China)

In order to clone Cryptopain-1 gene of different Cryptosporidium species for analysis of genetic variation,a pair of specifi c primers were designed based on the sequence of C. parvum Cryptopain-1 gene published on GenBank. The Cryptopain-1 genes of different Cryptosporidium species were amplified from their genomes using PCR technique and then cloned into pZeroBack/blunt vectors. The cloned genes from the positive recombinant plasmids were sequenced and phylogenetically analyzed. Cryptopain-1 gene of C. parvum shared nucleotide identities at 98.67%,94.53% and 98.34% with C. tyzzeri,C. meleagridis and C. cuniculus. The informationobtained from the present study will be useful for research on metabolism,pathogenecity of Cryptosporieium.

Cryptosporidium; cryptopain-1 gene; cloning; sequence analysis

S852.723

A

1674-6422（2014）05-0041-08

2014-03-07

国家科技重大专项项目（2012ZX10004220）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2013JB13）；家畜疫病病原生物学国家重点实验室开放基金课题（SKLVEB2013KFKT017）；上海市科技兴农重点攻关项目（沪农科攻字[2005] 第3-4 号）

王晓娟，女，硕士研究生，预防兽医学专业

陈兆国，E-mail：zhaoguochen@shvri.ac.c