胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型及中药有效成分的干预作用

屠亦文，郝瑞福

(1.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032；2.北京中医药大学附属东方医院，北京 100078)

胰岛素抵抗(IR)是指一定量的胰岛素与其特异性受体结合后生物效应低于正常，表现为外周组织尤其是脂肪、肌肉组织对葡萄糖的摄取障碍及肝葡萄糖输出增多[1]。目前用于胰岛素抵抗的细胞模型主要选择脂肪细胞、肌细胞和肝细胞3种。其中，3T3-L1脂肪细胞株是国内外广泛用于研究胰岛素抵抗机制的细胞株[2]，分化完全的3T3-L1脂肪细胞具有对胰岛素的高敏感性,并且具有较好的稳定性，因此3T3-L1脂肪细胞是研究体外胰岛素抵抗的理想模型。中药及其有效成分在改善IR方面的作用已被临床证实和广泛应用,3T3-L1脂肪细胞IR模型以及中药干预作用的研究也不断深入。

1 胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型

1.1 高糖高胰岛素 高糖高胰岛素状态下诱导的3T3-L1脂肪细胞IR模型是目前较为常见的造模方法，此方法较为成熟，且模型相对稳定。易屏等[3]将诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞用5 mmol/L葡萄糖加0.6 mmol/L的胰岛素作用18 h,可使3T3-L1脂肪细胞胰岛素刺激的葡萄糖转运抑制达60%。于乐[4]、李冀[5]等均采用高浓度葡萄糖(25 mmol/L)联合高浓度胰岛素(1×10-6mol/L)诱导培养的方法，建立了3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。吴汉荣等[6]的研究则显示，在低浓度葡萄糖状态下,胰岛素明显增加葡萄糖的转运，而在高浓度葡萄糖刺激下，胰岛素促进葡萄糖转运的作用明显减弱，可见高浓度葡萄糖可致细胞对胰岛素的敏感性减弱，导致胰岛素抵抗的发生。Ge X M等[7]认为，长时间异常水平的胰岛素作用同样能使细胞产生IR。同时,葡萄糖转运入脂肪细胞的转运速率也受葡萄糖浓度的影响。鉴于此种观点,官滨斌等[8]在诱导3T3-L1脂肪细胞IR模型的过程中将各组均给予相同浓度的低糖DEME,并给予胰岛素作用30 min，减少了由于葡萄糖浓度差异和胰岛素作用时间过长带来的误差，较正确地反映出细胞糖代谢能力和胰岛素敏感性。

1.2 游离脂肪酸 Lu H等[9]利用含0.5 mmol/L游离脂肪酸(FFA)的10%胎牛血清的DMEM高糖培养基孵育24 h后，可以建立3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型。张静等[10]研究表明，经0.25 mmol软脂酸(PA)或油酸(OA)体外作用6 h，3T3-L1脂肪细胞即可产生胰岛素抵抗，并且随作用时间延长和浓度增加而加重。同时发现高浓度PA长时间作用，基础状态下葡萄糖摄取亦显著下降。Boden等[11]则认为循环中FFA浓度过高以及细胞内脂质过多,既导致胰腺β细胞分泌胰岛素功能缺陷，又导致胰岛素抵抗的发生，此为FFA的“脂毒性”作用。佘美华等[12]将诱导成功的脂肪细胞用FFA或不用FFA分别处理6 h,然后用不同浓度的胰岛素诱导进行葡萄糖摄取的研究。结果显示,未加处理的3T3-L1脂肪细胞随着胰岛素浓度的增加其葡萄糖摄取量逐渐增加,而在较低浓度胰岛素刺激下，FFA处理的脂肪细胞对葡萄糖的摄入量变化不明显。

1.3 TNF-α和IL-6 有研究证实，炎症因子也可诱导3T3-L1脂肪细胞发生胰岛素抵抗,如Liu Kang等[13]采用TNF-α和IL-6的条件培养基持续刺激分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24 h后发现，炎症通路被激活，TNF-α和IL-6基因表达及蛋白释放均显著增加，胰岛素信号通路则受到抑制。郭红辉等[14]的研究则表明,TNF-α或H2O2处理6 h，脂肪细胞在胰岛素刺激后对葡萄糖的摄取能力明显降低,12 h后可以判定脂肪细胞处于胰岛素抵抗状态。同时发现,实验所采用的TNF-α或H2O2处理浓度和处理时间所产生的对细胞胰岛素敏感性的抑制效应可逆，而不是由于细胞毒害作用造成的。

1.4 地塞米松 王丽静等[15]选择不同浓度的地塞米松与3T3-L1脂肪细胞共同孵育48 h，观察处理前后3T3-L1脂肪细胞对胰岛素短时诱导的葡萄糖摄取量的变化，发现地塞米松抑制3T3-L1脂肪细胞的基础状态糖运转,且呈剂量依赖性。陈立等[16]对比游离脂肪酸、地塞米松、高糖高胰岛素3种目前常用的诱导3T3-L1脂肪细胞IR的造模方法诱导出的IR细胞葡萄糖转运率发现，3个造模组均可诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗，并且3组间差异无统计学意义。游离脂肪酸组最先失去胰岛素抗性,高糖高胰岛素组细胞产生胰岛素抵抗更强，而地塞米松组诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抗性介于两者之间。

1.5 其他 除此之外，还有用雌激素、葡糖胺、金属铬等诱导3T3-L1脂肪细胞产生胰岛素抵抗的报道。如Ge X等[17]用金属铬诱导3T3-L1前脂肪细胞产生胰岛素抵抗，结果表明，铬治疗确实能显著抑制胰岛素刺激的葡萄糖摄取和促使胰岛素信号衰减。但是相对文献较少，有待进一步深入研究。

2 中药有效成分对3T3-L1脂肪细胞IR干预作用

刘芳芳等[18]对黄连丸(黄连、生地黄)的有效成分小檗碱加梓醇对地塞米松诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的研究表明,两种中药均能增加葡萄糖消耗和转运，改善胰岛素抵抗，其作用不依赖胰岛素的存在，其配伍存在协同作用，并且能下调PPAR-γmRNA的表达，从而抑制前脂肪细胞分化成为成熟脂肪细胞，减少肥胖的发生。易屏等[3]研究小檗碱对3T3-L1胰岛素抵抗细胞模型PI-3K p85蛋白表达的影响，结果表明，小檗碱可以明显改善游离脂肪酸和高糖诱导的胰岛素抵抗，其分子机制可能与小檗碱提高PI-3K p85蛋白的表达有关。李迪等[19]研究酸味中药(如五味子、山楂、乌梅等)中的一种三萜类化合物熊果酸对3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型的干预作用。结果表明,熊果酸在改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型糖代谢的同时可抑制脂肪细胞的分化,这一机制可能与熊果酸上调3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型CAP-mRNA及蛋白的表达有关。殷惠军等[20]研究表明,西洋参茎叶总皂苷可改善游离脂肪酸诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗，其机制可能与其促进脂肪细胞CAP基因转录、GLUT-4转位和葡萄糖转运有关。李冀等[21]研究西洋参活性成分20(R)人参皂苷Rb1、20(R)人参皂苷Rb2、人参皂苷R3、拟人参皂苷F11发现，西洋参活性成分可以通过对高糖高胰岛素诱导的胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型FFA、IL-6、INF等脂肪细胞因子分泌的影响，调节脂代谢,从而达到改善胰岛素抵抗的目的。何燕铭等[22]研究蒲黄的主要成分蒲黄总黄酮对高糖高胰岛素诱导的3T3-L1脂肪细胞IR模型的影响，结果表明，蒲黄总黄酮能显著增加3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖摄取和消耗，同时可减少FFA溢出，通过调节糖代谢和脂代谢改善胰岛素抵抗,除了改善脂肪细胞对葡萄糖摄取，亦可提高其储脂能力,减少外周FFA的浓度。刘聪等[23]的研究则显示，灵芝多糖可改善地塞米松联合胰岛素诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗,其机制可能与灵芝多糖提高了胰岛素抵抗细胞的PI-3K p85和GLUT4蛋白表达相关。刘清霞等[24]观察番石榴叶三萜化合物积雪草酸对小鼠3T3-L1脂肪细胞增殖、分化以及胰岛素抵抗脂肪细胞糖脂代谢的影响发现，积雪草酸能显著改善脂肪细胞胰岛素抵抗，增加胰岛素抵抗脂肪细胞葡萄糖的消耗和减少游离脂肪酸的产生，其机制可能是其下调胰岛素信号转导的负性调节因子PTP1B的表达，增强胰岛素信号转导,从而改善胰岛素抵抗。胡锐等[25]研究葛根素对3T3-L1前脂肪细胞的增值和诱导分化的影响,以及在胰岛素抵抗状态下的对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢的作用，结果表明，葛根素对3T3-L1前脂肪细胞增殖无明显影响，能够促进3T3-L1细胞的分化，增加胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖代谢，且具有量效关系。于乐等[4]的研究显示,附子多糖在对脂肪细胞毒副作用较小的基础上可促3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的消耗,并可促进胰岛素抵抗模型脂肪细胞对3H-葡萄糖的摄取。郭晓农等[26]研究地黄寡糖对脂肪细胞增殖和胰岛素抵抗的影响发现，地黄寡糖可以促进前脂肪细胞的增殖,抑制脂肪细胞的增殖,地黄寡糖对地塞米松诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗具有明显的改善作用。陈思凡等[27]研究白藜芦醇(Res)对胰岛素抵抗状态下3T3-L1脂肪细胞葡萄糖代谢的影响，结果表明，Res可以明显改善胰岛素抵抗状态下3T3-L1细胞葡萄糖代谢。其机制可能是通过增加脂联素、瘦素表达,降低抵抗素表达从而介导AMPKα磷酸化实现的。

3 小结

综上所述，目前关于脂肪细胞IR模型的建立大多采用3T3-L1脂肪细胞分别与不同的诱导因子共同培养诱导，这些诱导因子主要包括:高胰岛素、高葡萄糖、游离脂肪酸、TNF-α、IL-6、地塞米松、金属铬、雌激素、葡糖胺等，而3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型作为目前研究相对成熟的IR模型，具有稳定、可靠、易于重复等优点，中药在改善胰岛素抵抗方面具有明显的优势，目前已证实小檗碱加梓醇、小檗碱、熊果酸、西洋参茎叶总皂苷及其他活性成分、蒲黄总黄酮、灵芝多糖、附子多糖、地黄寡糖、积雪草酸、白藜芦醇、葛根素等中药有效成分具有改善胰岛素抵抗、调节葡萄糖代谢的作用，其机制还有待于进一步的研究由此可见,胰岛素抵抗3T3-L1脂肪细胞模型对于在细胞及分子水平研究胰岛素抵抗的发病机制，以及改善胰岛素抵抗药物的筛选及其机制研究，都具有十分重要的意义。而中药有效成分对于胰岛素抵抗和葡萄糖代谢干预作用及其机制的深入研究，尚有较大的空间。

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