Farnesol作用变异链球菌脱矿的实验研究

徐双波，虞丽华，秦天牧，魏 昕

0 引 言

龋病是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生的慢性进行性破坏性疾病。龋病主要致病机制是菌斑内的致龋菌代谢碳水化合物产酸，造成局部微环境的PH值下降。酸进入牙齿硬组织，导致局部硬组织脱矿，羟磷灰石溶解破坏，无机钙、磷移出［1］。变异链球菌是公认的龋病致病菌，致龋性主要取决于产酸性和耐酸性［2］。变异链球菌通过细菌表面黏结素，识别唾液膜内的蛋白质受体-唾液凝集素、酸性富脯蛋白并发生特异性结合而介导变异链球菌黏附定居于牙面，形成牙菌斑，利用碳水化合物产酸，致牙齿局部环境PH值下降，釉质脱矿，进而产生龋病［3］。

变异链球菌的致病性受多种因素影响，如营养、温度、局部理化特点等，也受来自外环境的化学分子的影响［4］。Farnesol是一种具有生物活性的化学分子，分子式是C15H26O，它能抑制多种微生物的生长，如金黄色葡萄球菌［5］、表皮葡萄球菌［6］，也可抑制白色念珠菌酵母相向菌丝相的转变，并抑制白色念珠菌生物膜的形成［7］。本研究通过不同浓度Farnesol处理变异链球菌生物膜，扫描电镜观察牙釉质上附着的生物膜，采用显微硬度计检测表面显微硬度(surface microhardness，SMH)以及粗糙度仪检测表面粗糙度(Ra)，研究Farnesol作用变异链球菌后其脱矿能力的改变。

1 材料与方法

1.1 研究试剂和仪器 心脑浸液培养基(BHI培养基)，BHI溶液(含1%蔗糖)，E和E-Farnesol(Sigma公司，美国)。变异链球菌UA159由中国微生物研究所惠赠。

低速金刚砂切片机(Isomet ILL，Evanston，Buehler Ltd，美国)，显微硬度计(DHV-1000，上海尚材试验机有限公司)，扫描电子显微镜(LEO 1530 VP，德国)，表面粗糙度仪(TR240型，北京时代集团公司)，低温高速离心机(EPENDORF，德国)，紫外可见光分光光度计(BIOMETRA，德国)，YCP系列二氧化碳培养箱(易亮医疗器械有限公司，上海)。

1.2 实验牙的选择和牙釉质片的预备 选择因正畸减数而拔除的下颌前磨牙，要求无龋坏、无发育不良等疾患。体视显微镜下观察釉质无白斑、无裂痕，牙齿拔下后，等渗盐水冲洗干净，放入4℃冰箱保存，于拔牙后1周内使用。

将30颗牙使用低速金刚砂切片机分离冠根，取牙冠的长轴方向切割出厚度约2mm的釉质片，在釉质片表面形成实验开窗区(4 mm×4 mm)，非实验区域用防酸指甲油双层封闭，牙釉质片用70%乙醇消毒，然后用无菌去离子水冲洗，并用紫外灯照射60 s(正反面各30 s)。

1.3 细菌生物膜形成和Farnesol处理［8］将-80℃保存的变异链球菌复苏，传代至BHI液体培养基中，在37℃厌氧(80%N2、20%C02)条件下培养48h，取6支培养试管，在其中加入等量的菌悬液(30 μL)，悬液经离心机3100×g，离心5min，弃上清后调整菌悬液浓度为5×108CFU/mL。实验分为 5组，即变链 +0 μmol/L Farnesol组、变链 +50 μmol/L Farnesol组、变链 +100 μmol/L Farnesol组、变链+200μmol/L Farnesol组和对照组。Farnesol处理组含有1.5 mL标准菌悬液，分别加入浓度为 0、50、100、200 μmol/L 的 Farnesol，对照组中加入1.5mL、无菌去离子水。将预备好的牙釉质片置于24孔板中，加入菌悬液培养，37℃静置培养。变异链球菌黏附在牙釉质片表面形成生物膜。

24、48、72 h 3个时间点换液，分别取出24孔板中菌悬液，加入新鲜的BHI培养液(含1%蔗糖)，同时加入相应剂量Farnesol，维持实验组50、100、200 μmol/L的Farnesol浓度。

1.4 扫描电镜观察 将上述5组牙釉质片从24孔板中取出，干燥后固定于样品台，镀膜，扫描电镜观察。

1.5 显微硬度值测定 将上述5组牙釉质片用无菌去离子水冲洗吹干，分别在实验前后测定釉质的SMH值。牙釉质片用特制的夹具固定，找平，用维氏金刚锥压头，加载0.980 7 N的负荷，持续打压牙片开窗区15 s，使其形成压痕，通过分析系统测量压痕的两对角线长度，计算出硬度值，标本内每个釉面测量5次，取平均值作为该样本的硬度值，单位为HV(N/mm2)。实验后采用同样方法进行釉质标本开窗处的显微硬度测试。

1.6 表面粗糙度检测 用表面粗糙度仪测定试样釉面粗糙度，测定参数为取样长度内轮廓偏距的算术平均值(Ra)，每个试样表面测3个区域，每个区域取5个测试段，每段取样长度为0.25mm，结果取平均值。

1.7 统计学分析 采用SPSS13.0软件进行统计分析，实验前后的SMH的比较选用配对t检验，各组SMH及粗糙度值之间比较选用单因素方差分析，两两比较采用SNK法。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Farnesol对釉质表面变异链球菌生物膜的影响 扫描电镜结果显示，釉质表面覆盖一层较厚的变异链球菌生物膜，其厚度及面积随着Farnesol浓度的增加而减少。其中变链 +0 μmol/L Farnesol组、变链 +50 μmol/L Farnesol组、变链 +100 μmol/L Farnesol组、变链 +200 μmol/L Farnesol组的生物膜厚度均值依次为 45、32、20、6 μm。

2.2 脱矿后釉质SMH测定结果 各组的实验前后显微硬度值、均值及标准差见表1。

结果表明:实验前，5组釉质片表面SMH值经统计学分析差异无统计学意义(P＞0.05)，即在实验前各釉质的表面SMH值是相同的。实验后，4组实验组釉质表面硬度都有减低，差异有统计学意义(P＜0.01)。实验组SMH值的降低较对照组相比，差异有统计学意义(P ＜0.01)。变链 +0 μmol/L Farnesol组即未加入Farnesol组SMH值的较其余3实验组降低，差异有统计学意义(P ＜0.01)，200μmol/L Farnesol组SMH 值明显高于变链 +50 μmol/L Farnesol、变链 +100 μmol/L Farnesol组，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

图1 变异链球菌生物膜扫描电镜结果Figure 1 The results of SEM on biofilm of Streptococcus mutans

表1 经不同处理牙釉质脱矿后釉质SMH测定结果(±s，N/mm2)Table 1 Enamel SMH before and after experiment with different solution(±s，N/mm2)

表1 经不同处理牙釉质脱矿后釉质SMH测定结果(±s，N/mm2)Table 1 Enamel SMH before and after experiment with different solution(±s，N/mm2)

经方差分析可见处理前方差分析F=1.2536，P＞0.05，处理后方差分析 F=7.644 5，P＜0.01，处理前后差值方差分析 F=10.563 4，P ＜0.01

组 别 n 实验前 实验后 差值d t值 P值对照组 30 372.83 ±8.18 368.60 ±7.33 3.98 ±8.20 0.51 0.73变链 +50 μmol/L 组 30 367.48 ±8.63 224.63 ±18.98 150.59 ±4.85 9.86 ＜0.01变链 +100 μmol/L 组 30 369.42 ±10.23 228.06 ±10.40 148.63 ±8.56 18.23 ＜0.01变链 +200 μmol/L 组 30 381.53 ±8.35 270.87 ±12.19 115.54 ±6.84 16.83 ＜0.01变链 +0 μmol/L 组 30 373.70 ±8.69 198.57 ±8.19 170.46 ±12.03 28.90 ＜0.01

2.3 Farnesol对釉质表面粗糙度的影响 实验后4组的粗糙度值从大到小依次为变链+0 μmol/L Farnesol、变 链 +50 μmol/L Farnesol、变 链 +100 μmol/L Farnesol、变链 +200 μmol/L Farnesol，即随着Farnesol浓度的增加，釉质粗糙度下降，4组之间差异有统计学意义(P＜0.05)。见图2。

图2 各组粗糙度值Ra(±s，nm)Figure 2 The roughness of five groups(±s，nm)

3 讨 论

龋病的发生与变异链球菌生物膜脱矿密切相关［9］，目前国内外研究证明Farnesol可抑制变异链球菌生物膜内酸的产生以及葡萄糖的分解代谢［10］，但Farnesol作用变异链球菌后其脱矿能力的影响未得到充分的研究。本研究发现，加入不同浓度的Farnesol，经过变异链球菌生物膜作用72 h后，釉质SMH及粗糙度均有显著变化。对照组釉质粗糙度均值为46.6 nm，经过生物膜作用后，粗糙度均有不同程度的增加，200 μmol/L Farnesol组粗糙度100.35 nm，增加的幅度最小。显微硬度经Farnesol作用后均有不同程度的降低，200 μmol/L Farnesol组显微硬度值明显高于其余实验组。扫描电镜观察显示在同样的观察范围内，附着于釉质表面的变异链球菌生物膜的生长有差异，200 μmol/L Farnesol组密度及厚度明显少于其余实验组。

显微硬度即显微压痕硬度的简称，显微压痕硬度测定是目前测量釉质硬度的主要方法。1983年Featherstone等［11］利用定量显微放射照相术测得牙釉质矿物质的含量，发现与显微硬度计测得的硬度值有很好的直线相关关系，显微硬度大，矿化程度就高。ZERO也证明显微硬度对于非常早期的釉质脱矿具有很强的灵敏性［12］。正常或脱矿的釉质中，显微硬度能反映釉质的矿化程度及矿物质含量的多少。本研究所用标本皆为本院因正畸需要拔除的下颌前磨牙，为年轻恒牙，将年龄因素对实验结果的影响降到了最低。研究采用随机数字表法分组，减少了牙齿特异性对实验结果的影响，可比性好。本实验通过测定显微硬度的变化，来定量评价不同浓度外源性Farnesol对变异链球菌釉质脱矿的影响。实验前各组显微硬度平均值高于有关文献中牙釉质表面硬度值［13］，这是由于本实验中所选的标本均为年轻恒牙，均为下颌前磨牙，矿化程度较高。用扫描电镜对釉质表面的变异链球菌生物膜进行检查，发现生物膜在釉质表面的覆盖面积和厚度并不均匀，一般由几层细菌细胞组成，含有300个左右的细菌，厚度为3～45 μm。扫描电镜观察生物膜的检测方法已被广为认可［14］。

本研究Farnesol浓度梯度的选择是参照了已有的实验报告，研究发现50～200 μmol/L Farnesol可以不同程度抑制金黄色葡萄球菌的生长［15］，另有研究证实Farnesol与微生物的耐药性存在一定的相关性，一定浓度的Farnesol可抑制都柏林菌菌株的耐药性［16］，且随着 Farnesol(0 ～300 μmol/L)浓度的增高抑制作用逐渐增强。Farnesol对白念珠菌生物膜的形成也有影响，在300 μmol/L时则完全抑制白念珠菌导致无法形成生物膜。当Farnesol浓度超过400 μmol/L，可以诱导变异链球菌细胞的凋亡［15］。

通过研究发现，随着Farnesol浓度的增加，抑制釉质表面硬度的降低，表面粗糙度增加，说明不同浓度Farnesol对变异链球菌釉质脱矿的影响有一定的差异。在Farnesol浓度为200 μmol/L时作用最强。关于Farnesol对变异链球菌生物膜脱矿的分子作用机制，尚须进一步实验研究。

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