Th17细胞和IL-23/IL-17轴在肺纤维化大鼠肺组织动态表达的意义

鲍文华，梁建合，李树民，孙云晖，阎红娥

0 引 言

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种不明原因引起进展性肺实质组织纤维疤痕化和肺功能不可逆性丧失的慢性肺疾病，多发于老年人。其发病率和病死率日渐增高，全球已超过500万人肺部呈现出不同程度PF，临床表现为进行性呼吸困难，终末期常死于呼吸衰竭，确诊后的患者平均生存时间为2～4年，其五年生存率为30%～50%［1］。目前，IPF发病机制仍未明确，尚缺乏有效的诊治措施。Raghu等［2］研究证实，在肺纤维化过程中多种炎症因子发挥着关键作用。Th17细胞是一种独特效应性CD4+T细胞亚群，介导多种慢性炎症、自身免疫性疾病和肿瘤的发生发展［3］。本研究的前期工作发现Th17细胞及部分相关因子参与IPF的发病机制［4-5］。故本研究旨在检测大鼠PF模型Th17细胞、IL-23R以及血清IL-17含量的动态表达，探讨Th17细胞和IL-23/IL-17轴在PF发病中的作用，从而为临床诊断和治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠63只，体重(210±20)g，清洁级，由大连医科大学实验动物中心提供［动物合格证号 ISCXK(辽)2008-0002］，按清洁级标准正常饲养。

1.1.2 主要实验试剂 注射用盐酸博来霉素(日本化药株式会社)、一抗:IL-23R单克隆抗体(美国abcam公司)、二抗SP试剂盒、DAB显色试剂盒、羟脯氨酸试剂盒 、IL-17 ELISA试剂盒均购于天津市金圣生物试剂公司;小鼠抗大鼠单克隆流式抗体APC Mouse Anti-Rat CD3、PerCP Mouse Anti-Rat CD8a、抗小鼠/大鼠单克隆抗体Anti-Mouse/Rat IL-17A FITC及同型对照、固定/破膜剂、Lysing Buffer溶血素(美国BD Pharmingen公司)均购于北京利文公司;胶原酶Ⅴ、离子霉素、PMA(美国Sigma公司)均购于北京利文公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组和模型制备 采用随机数字表法将大鼠分为对照组(对照组)、肺纤维化模型组(模型组)及地塞米松干预组(地塞米松组)，每组21只。各组大鼠使用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)行腹腔注射麻醉后，仰卧于鼠板上固定，颈部备皮，常规消毒，剪开颈部正中皮肤，钝性分离暴露气管，保证气道通气，取两软骨环间穿刺，约到气管分叉处，模型组、地塞米松组快速推注入博来霉素(0.5 mg/100 g)，对照组气管内注入等渗盐水。向气管内再次注入0.2 mL的空气2～3次，立即将其直立，以身体长轴为中心，快速正反旋转鼠板1～2min，使药物在两肺内分布均匀，缝合皮肤，动物室饲养。地塞米松组次日开始，每天行地塞米松注射液(0.3 mg/100 g)腹腔注射，对照组、模型组使用等渗盐水腹腔注射。

1.2.2 动物的处死和标本采集 各组大鼠分批于第7、14、28天，随机取7只大鼠，行眶后动脉放血处死。收集外周血1 mL，离心(3000 r/min、15 min、离心半径10 cm)，留取血清，用于IL-17检测;心肺分离，留取肺组织，取右上肺行固定、脱水、石蜡包埋、切片，行HE染色法观察肺组织病理的动态变化和免疫组化法评估IL-23R的表达;取右中下肺约100 mg，置Ep管内，-70℃保存，检测肺组织中HYP;留取左上肺50 mg，制备单细胞悬液，检测肺组织Th17细胞百分率。

1.2.3 外周血IL-17及肺组织HYP含量检测 分别采用ELISA法和碱水解法检测外周血IL-17及肺组织HYP含量，严格参照试剂盒说明书进行操作。

1.2.4 肺组织IL-23R表达水平 采用免疫组织化学法评估，依次通过切片、脱蜡、水化、消除内源性过氧化物酶活性、抗原修复后，加血清封闭液孵育，滴加一抗过夜，PBS冲洗，加入二抗孵育，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染。阳性组织切片:细胞质出现棕黄色颗粒;阴性组切片:细胞质内无棕黄色反应物，细胞核为蓝色。400倍显微下照相，使用image proplus细胞图像分析系统对每张切片阳性染色的平均灰度值进行评分，具体标准参见文献［6-7］。

1.2.5 肺单细胞悬液制备 参照文献［8-9］采用胶原酶Ⅴ消化法制备，取左肺约50 mg，超净工作台内，无菌PBS清洗肺组织后，眼科剪将肺组织剪成0.5～1 mm3小块，然后采用消化法(胶原酶Ⅴ消化液)将组织制成肺单细胞悬液，细胞计数1.0 ～3.0 ×107个/L。

1.2.6 CD3+CD8-IL-17+Th17细胞检测 采用流式细胞术检测，用RPMI-1640培养基将肺组织单细胞悬液浓度调整到1～2×106个/mL，然后依次加入(PMA、离子霉素、BFA)刺激剂 ，孵育(37℃、5%CO2、5 h)，胞外染色(CD8 和 CD3 抗体)，溶血，破膜通透，胞内染色(IL-17 PE)。上机检测:加入0.5 mL的鞘液，在CellQuest软件下，获取10万个细胞。应用BD FACS Aria流式细胞仪分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析。实验结果以均数±标准差(±s)表示。采用单因素方差分析和组间多重比较，方差齐采用LSD-t检验，方差不齐采用Games-Howell检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠肺组织病理学变化 大体标本观察对照组大鼠两肺为淡红色、质软、肺表面富有弹性，无肿胀和出血点。模型组、地塞米松组第7天两肺出现明显水肿，可见点状或片状出血灶;第14天两肺肿胀部分消退，为灰白色，质较实硬，弹性较差，肺表面可见灰白色小斑块;第28天两肺体积有所缩小，肿胀消退，质地硬，为苍白色，肺表面出现结节样和条索状病灶。在相同时间点上，地塞米松组大鼠肺组织病变程度及范围较模型组明显减轻。

光镜观察对照组肺组织结构清晰完整。模型组大鼠第7天可见大量炎症灶，肺泡腔及间隔内浸润大量中性粒细胞和单核巨噬细胞，肺泡萎缩，肺泡间隔增宽且水肿，肺毛细血管充血，成纤维细胞增多;第14天大鼠肺组织肺实质炎症较前有所吸收，仍有较明显炎性细胞浸润，肺泡结构部分丧失，胶原纤维增生和成纤维细胞增殖，造成肺泡间隔进一步的增宽;第28天肺实质炎症基本吸收，少量炎性细胞浸润，可见肺泡壁断裂腔，肺泡结构破坏、消失，肺泡间隔内大量纤维细胞增殖和胶原纤维沉积，导致肺泡隔显著增厚，纤维组织为瘢痕条索样改变。地塞米松组与模型组病理变化基本相同。同一时间点相比，其炎症细胞的浸润及纤维细胞增殖和胶原纤维增生程度轻于模型组。见图1。

2.2 各组大鼠肺组织中HYP含量的变化 模型、地塞米松组的HYP含量在各时间点均明显高于对照组(P＜0.05)，第7天开始升高，第28天到达高峰;在不同时间点，地塞米松组数值低于同期模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。具体结果见表1。

2.3 各组大鼠外周血中IL-17的变化 与对照组相比，模型、地塞米松组外周血IL-17水平在各时间点显著增高(P＜0.05)，且在第7天达到高峰后后逐渐降低，第28天时仍高于对照组。与同期模型组外周血IL-17含量相比较，地塞米松组含量低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

2.4 各组大鼠肺组织 CD4+、IL-17+、Th17细胞和IL-23R的表达 模型组在不同时间点明显高于对照组(P＜0.05)，数值以第7天最高，且呈逐渐降低的趋势，第28天时仍高于对照组。地塞米松组与模型组表现出相同的变化趋势，低于同期模型组、高于对照组，差异均具有统计学意义(P＜0.05)。见表 3、表 4。

图1 各组大鼠肺组织HE染色镜下所见(×200)Figure 1 HE staining of pulmonary tissues in each group(×200)

表1 各组大鼠不同时间点肺组织中HYP含量的比较(±s，μg/mg)Table 1 Comparison of HYP contents in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，μg/mg)

表1 各组大鼠不同时间点肺组织中HYP含量的比较(±s，μg/mg)Table 1 Comparison of HYP contents in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，μg/mg)

与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

组别 n HYP第7天 第14天 第28天7 1.13 ±0.04 1.12 ±0.03 1.12 ±0.03模型组 7 1.65 ±0.03* 30.72 ±1.51* 43.38 ±2.32*地塞米松组 7 1.56 ±0.04*#22.54 ±1.44*# 32.09 ±1.06*#对照组

表2 IL-17在各组大鼠不同时间点血清中的水平(x ± s，pg/mL)Table 2 Levels of IL-17 in serum of rats in each group at different time points(±s，pg/mL)

表2 IL-17在各组大鼠不同时间点血清中的水平(x ± s，pg/mL)Table 2 Levels of IL-17 in serum of rats in each group at different time points(±s，pg/mL)

与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

组别 n IL-17第7天 第14天 第28天7 7.40 ±0.37 7.41 ±0.36 7.41 ±0.38模型组 7 54.04 ±1.52* 34.22 ±1.31* 24.58 ±1.23*地塞米松组 7 39.22 ±1.38*#28.28 ±1.26*# 18.63 ±1.12*#对照组

表3 各组大鼠不同时间点肺组织中的CD4+IL-17+Th17细胞百分率(±s，%)Table 3 Ratio of CD4+IL-17+Th17cell in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

表3 各组大鼠不同时间点肺组织中的CD4+IL-17+Th17细胞百分率(±s，%)Table 3 Ratio of CD4+IL-17+Th17cell in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

组别 n CD4+IL-17+Th17第7天 第14天 第28天7 0.79 ±0.05 0.79 ±0.02 0.79 ±0.03模型组 7 9.60 ±0.43* 6.62 ±0.28* 4.40 ±0.22*地塞米松组 7 8.63 ±0.32*# 4.99 ±0.25*# 3.28 ±0.18*#对照组

表4 各组大鼠不同时间点肺组织中IL-23R的表达(±s，%)Table 4 Expression of IL-23R in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

表4 各组大鼠不同时间点肺组织中IL-23R的表达(±s，%)Table 4 Expression of IL-23R in pulmonary tissues of rats in each group at different time points(±s，%)

与对照组比较，*P＜0.05;与模型组比较，#P＜0.05

组别 n IL-23R第7天 第14天 第28天7 31.21 ±2.16 30.81 ±2.02 30.27 ±2.23模型组 7 189.37 ±11.43* 167.26 ±9.52* 108.33 ±6.13*地塞米松组 7 154.13 ±10.28*#127.01 ±8.64*# 84.07 ±5.63*#对照组

3 讨 论

PF是间质性肺疾病的终末结局，其病理变化表现为肺泡上皮细胞的损伤、肺泡结构破坏和过度纤维组织增殖的动态过程［10］。有文献报道，肺内HYP含量与胶原含量是具有确切的数量关系，而肺成纤维细胞是合成胶原的主要细胞，因此肺组织中HYP含量变化可以反应肺组织纤维化程度［10］。观察本次实验结果发现模型组大鼠肺组织病理变化，早期以肺泡炎症改变为主，可见炎症细胞大量浸润，成纤维细胞略有增多;晚期则以肺间质纤维化为主，可见炎症吸收，炎性细胞浸润较前明显减少，成纤维细胞显著增生，肺泡萎缩或消失;HYP含量呈现出逐渐升高的变化趋势。提示用BLM制备PF模型成功。

目前，细胞因子参与PF过程中机制的研究日益成为热点。有学者认为细胞因子调控失衡是造成PF的基础，尤其是Th1/Th2型细胞因子失衡起到主要作用。但近年来，大量的动物实验证明起到关键作用的可能并不是 Th1/Th2型细胞因子［11-13］。Th17细胞是由在TGF-β和 IL-6作用下活化的初始T细胞分化而来的一个独立特殊CD4+T细胞亚型［14-15］，其分化调节与IL-23密切相关，且分泌特征性炎症细胞因子IL-17［16］，表达趋化因子受体6及IL-23R。作为一类介导炎症反应的重要效应T细胞，与Th1、Th2辅助细胞以及T调节细胞3种传统的CD4+T细胞亚群具有不同的细胞生物学和分化调节功能［17-18］，通过IL-23/IL-17轴在介导宿主防御和自身免疫性疾病及变态炎症反应中发挥着重要作用［19］。IL-23是一种促炎细胞因子，并不能直接诱导原始T细胞分化为Th17细胞，由于IL-23R仅表达于激活和/或记忆的T细胞，初始 Th17祖细胞并不表达，而IL-23必须与其受体IL-23R结合后以介导激活的记忆T细胞产生IL-17，其是Th17细胞维持、增殖的重要因子［20］。

本研究发现，在BLM诱导的PF大鼠模型中，肺组织Th17、IL-23R和外周血IL-17水平明显升高，尤其以肺泡炎时最为显著。提示Th17细胞及其相关因子IL-23R、IL-17参与肺组织肺泡炎和肺纤维化过程，尤其是在PF早期肺泡炎阶段，这与相关研究实验结果相同［21］。其机制可能为BLM造成大鼠肺组织损伤，产生肺泡炎，导致大量的炎症细胞招募至炎性病灶释放大量炎症因子，其中TGF-β和 IL-6可诱导初始T向Th17细胞分化，在IL-23和IL-21协同下，调高IL-23R在Th17细胞表面的表达，IL-23通过与其受体结合后，JAK-STAT信号途径被激活，磷酸化的分子信号转导和转录激活因子3介导Th17的特异性转录因子RORγt高表达，从而促进Th17细胞分泌IL-17和增强在体内的稳定和扩增。IL-17则诱导炎症细胞参与前炎症反应，放大致炎效应，同时还可以介导与组织纤维化密切相关的细胞因子(IL-6、碱性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子和肝细胞生长因子等)高表达，从而参与到肺组织纤维化过程。Th17、IL-17与 PF有关，由 Dubin等［22］首次提出。在研究肺的囊性纤维化过程中，他们发现当囊性纤维化急性发作时，T细胞、Th17、IL-17A、IL-23在小鼠支气管肺泡灌洗液和痰中的浓度明显升高，给予抗炎干预后均有下降;Tan等［23］进一步证实囊性纤维化患者支气管肺泡灌洗液中CD4+T、IL-17 呈高水平表达。Decraene等［24］通过在评估PF患者痰液中的IL-17A、IL-23 mRNA表达及蛋白水平，证实了IL-23、IL-17A参与PF的炎症及病理发展过程，并发挥重要作用。

值得注意在本研究中注射BLM后第2天，给予地塞米松抗炎治疗后，Th17、IL-23R和IL-17表达量在同一时间点与模型组相比均显著下降，HYP增高和PF程度减弱，且三者在不同时间点变化趋势相同，提示地塞米松可能通过干扰IL-23/IL-17炎症轴某个关键点，抑制Th17表达IL-17，但与同期的对照组相比具有显著差异，故并不能排除有其他机制在发挥作用。

总之，PF大鼠模型肺组织TH17细胞、IL-23R和血清IL-17表达增高，并与肺部炎症、PF程度密切相关，提示其可能参与PF形成过程，其确切的机制有待进一步研究。

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