p53与Gadd45a蛋白在胃癌组织中的表达及临床病理学意义

闫美凤，张永胜

0 引 言

胃癌是世界范围内占恶性肿瘤发病率第4位(约占全球恶性肿瘤发病的7.8%)，死亡率占第2位(约占全球恶性肿瘤死亡的9.7%)的一种恶性肿瘤疾病［1-2］。而胃癌在我国的发病率及死亡率均居于首位。有资料显示，我国每年大约新增胃癌患者40万，其中近3/4的患者死亡［3］。胃癌的发生、发展是多因素、多步骤的复杂过程［4］。人类p53基因定位于17号染色体(17q13.1)，编码由393个氨基酸组成的相对分子质量为53000的蛋白质。p53蛋白与DNA密切结合，具有转录监管的功能，还可以作为抑癌基因抑制异常细胞的增殖以及保持基因组的完整性。若p53基因在内在或外在因素的刺激下发生改变，则会导致p53蛋白失去对细胞的转录控制的部分功能，使细胞因遗传不稳定而发生恶变，形成肿瘤［5-6］。Gadd45a是生长抑制 DNA损伤基因(growth arrest and DNA-damage-inducible protein 45，Gadd45)家族中的一员。该家族的功能涉及对细胞凋亡、生存、衰老进程的调节，细胞周期的调控及DNA损伤的修复。Gadd45a是第1个被检出的p53下游靶基因。在Gadd45a基因中，p53调节区定位于该基因的第3内含子。受p53基因上调，该基因控制细胞周期的G2/M期，从而控制细胞增殖/凋亡的平衡［7］。董明等［8］和高其忠［9］研究表明，p53 和Gadd45a蛋白在胰腺癌、乳腺癌组织中均有较高表达。目前关于p53与Gadd45a在恶性肿瘤组织中表达的研究主要集中于基因测序方法，存在测序程序复杂、费用高，且p53与Gadd45a基因突变位点多等问题。先前研究表明，运用免疫组织化学方法检测靶蛋白的表达可以反映90%以上的对应靶基因状态［10］。本研究将采用免疫组织化学方法检测胃癌组织及癌旁组织中p53与Gadd45a蛋白的表达情况，探讨其可能的临床病理意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2009年5月至2012年7月间内蒙古医科大学附属医院及内蒙古自治区人民医院普外科收治，具有完整临床资料记录，且术前未经放疗、化疗，全部病灶行手术切除的101例胃癌患者手术切除的癌及癌旁组织标本。所有标本都经病理科医师确诊病变程度。每例标本经4%多聚甲醛固定液固定，常规石蜡包埋、切片。101例患者中，男性81例、女性20例，年龄21～81岁，平均(53.6±11.2)岁。分化程度:高分化腺癌14例、中分化腺癌52例、低分化腺癌35例。根据第6版(2002年)国际抗癌协会(Union for International Cancer Control，UICC)的UICC/TNM分期标准分为Ⅰ期5例、Ⅱ期12例、Ⅲ期75例、Ⅳ期9例。

1.2 实验用试剂 Gadd45a兔抗人单克隆抗体(货号H00001647-MO1);p53鼠抗人单克隆抗体(货号MAB-0142);免疫组织化学SP染色试剂盒(货号KIT-9710)购自福建迈新生物工程有限公司。

1.3 实验方法 采用SP免疫组织化学方法检测。石蜡包埋组织切片(4 μm)经常规脱蜡至水，按试剂盒操作说明进行，微波抗原修复，Gadd45a抗体和p53抗体(2种抗体均为1∶100稀释)，PBS代替第一抗体作阴性对照，DAB显色，苏木精复染，二甲苯透明，中性树胶封固。

1.4 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件对数据进行分析。实验数据均以均数±标准差(±s)表示。p53和 Gadd45a表达的相关性分析采用Spearman检验;组间比较采用t检验，以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁组织的表达 p53以核表达为主，Gadd45a为细胞质表达，阳性染色呈棕黄色或棕褐色颗粒物表达。每张染色的切片随机选取5个视野，利用捷达801生物显微图象分析系统对Gadd45a、p53蛋白表达进行分析，以蛋白的阳性表达率来判定结果。即＞20%的肿瘤细胞核内棕褐色颗粒着色者为p53蛋白阳性表达;＞50%的肿瘤细胞细胞质内棕褐色颗粒着色者为Gadd45a蛋白表达阳性。见图1。

2.2 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁组织的表达及相关性 p53蛋白在癌组织中的表达较癌旁组织高，差异有统计学意义(P＜0.05);而Gadd45a蛋白的表达情况与其相反。两者在癌组织中的表达与组织的高、低分化程度、淋巴结转移、TNM分期的差异有统计学意义(P＜0.05)。p53和Gadd45a蛋白的表达经Spearman等级相关性检验提示，两者之间无相关性(rs=-1.54，P ＞0.05)。见表1。

2.3 p53和Gadd45a阳性表达与性别、年龄关系 101例患者中，胃癌及癌旁组织中，p53蛋白表达的阳性率分别为67.33%、12.97%。Gadd45a蛋白表达的阳性率分别为33.79%、79.18%，两者在癌组织与癌旁组织的表达差异有统计学意义(P＜0.05)。不同性别、年龄间患者p53与Gadd45a阳性表达率在癌组织与癌旁组织间差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

图1 p53和Gadd45a蛋白在胃癌及癌旁组织表达的免疫组化结果(SP×100)Figure 1 The results of the expression of p53 and Gadd45a protein in gastric cancer and cancer adjacent tissues by immunohistochemical technique(SP×100)

表1 p53和Gadd45a蛋白的表达与胃癌患者的临床病理参数(%)Table 1 The relationship between the expression of p53 and Gadd45a protein and clinical pathological parameters in patients with gastric cancer(%)

表2 p53和Gadd45a阳性表达与性别、年龄关系(%)Table 2 The relationship between the positive expression of Gadd45a and p53 protein and gastric cancer patients'gender，age(%)

3 讨 论

p53蛋白的异常表达与胃癌的发生发展有关，检测p53蛋白水平对胃癌的诊断有一定价值［11］。p53基因分为野生型和突变型2种，其产物也有野生型与突变型。突变型p53促进细胞增殖与凋亡。野生型p53蛋白的半衰期短，免疫组化染色不能检出，免疫组化染色者均为突变后丧失原有功能的p53蛋白。本实验结果表明，p53蛋白随着胃癌组织由高到低的分化程度、TNM分期(Ⅰ-Ⅳ)表达逐渐增强，差异有统计学意义。按淋巴结有无转移将胃癌分为2组，p53蛋白表达在淋巴结转移组的阳性率明显高于淋巴结未转移组，差异有统计学意义。与文献报道的p53蛋白的过度表达在胃癌黏膜细胞癌变过程中其重要作用，并与胃癌进展相关的结论相一致［12］。

近年来的研究显示，Gadd45a是DNA损伤后诱导表达的基因之一，也是抑癌基因p53和BRCA1的下游靶基因。其基因序列具有很高的同源性，通常在环境损伤因子(如紫外线放射、低氧、基因毒性药物等)作用后随着DNA修复途径的启动而诱导产生［13］。细胞DNA损伤诱导Gadd45a表达使细胞发生G2/M期阻滞，调节细胞凋亡和存活等多条信号传导通路、在决定细胞命运中有着重要的作用［14］。本研究中应用免疫组化的方法检测了101例胃癌患者肿瘤组织和癌旁组织中Gadd45a的表达情况，结果显示其在癌旁正常组织中的表达明显高于肿瘤组织，并且随着肿瘤组织分化程度(由高到低)、TNM分期的增高表达有下降的趋势。结果与文献报道相一致［15］。此外，本研究还开展对p53与Gadd45a两者蛋白表达的Spearman等级相关性分析，结果显示两者之间无相关。究其原因可能为:①胃癌的发生是多种癌相关基因协同作用的结果。不同基因间信号调节具有复杂性。本组所研究的癌相关基因Gadd45a既可以通过依赖于p53基因路径，也可以通过独立于p53基因路径参与影响细胞凋亡过程。②单纯依靠免疫组织化学方法检测p53与Gadd45a蛋白在肿瘤组织中的表达，不能完全准确地反映对应靶基因状况;③可能与本组研究的病例数有限有关。

综上所述，本研究结果表明胃癌组织中Gadd45a与p53基因在分化程度、有淋巴结转移、病理分期较晚的胃癌组织中表达发生变化，而与年龄、性别无关，说明Gadd45a与p53基因胃癌组织的增殖、侵袭和转移中起到重要的作用并与胃癌的发生发展密切相关。Gadd45a在体内发挥的作用机制复杂，在不同的条件下机制和功能都相应转化。随着肿瘤研究的深入，Gadd45a在决定细胞存活或是凋亡中发挥的作用会越来越明确，这将进一步为在生物领域的应用奠定基础。联合检测胃癌组织标本中Gadd45a与p53的表达在临床诊断治疗方面有进一步研究价值。

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