pp3501抑制肝癌细胞生长的初步研究

刘慧明，丁 航，张海涛

0 引 言

化疗是肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma cells，HCC)最常用的治疗手段，但化疗毒性限制其应用。肿瘤治疗的突破很可能依赖于新型药物的开发和基因治疗技术的成熟，寻找新的适合基因作为靶基因将是基因治疗的一个重要方向。

pp3501最早是Wan等［1］报道，他们利用大规模cDNA转染法，在基因组水平上对影响肝癌细胞生长的基因进行功能扫描，搜索了大量对细胞生长有影响的相关基因，共获得3806个基因，并将这些基因分别标记，其中1个序列标记为pp3501，并在Genbank登记了pp3501 mRNA的序列。目前pp3501的功能尚不明确，本研究探讨pp3501对肝癌细胞生长的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 3株肝癌细胞系(HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5)购自American type culture collection(Rockville，MD，USA)，保存在广东医学院生物化学与分子生物学研究所。所用细胞系均用含10%胎牛血清(杭州四季青)的Dulbecco's modified Eagle培养基(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)并加入青霉素(100 U/mL)和链霉素(100 μg/mL)于37℃、5%CO2环境培养。3株肝癌细胞系分别设空白组、对照组(转染空质粒pEGFPN1入HCC细胞)、pp3501组(将 pEGFPN1-pp3501转染入HCC细胞)。

1.2 试剂 MTT，propidium iodide购自 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。兔抗或羊抗等一抗和相应二抗购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)，EcoR I、Sal I内切酶。

1.3 pEGFPN1-pp3501重组质粒的构建 PCR扩增pp3501开放阅读框序列，并在上下游引物中分别加上EcoR I，Sal I酶切位点。上游引物:5'-GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3'，下 游 引物:5'-TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3'。反应条件:94℃变性3 min，进入循环，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 30s，30 个循环，72℃ 5min。普通琼脂糖电泳鉴定，并用 QIAquick®Gel Extraction Kit试剂盒切胶回收。双酶切pp3501回收产物(EcoR I，Sal I)，酚/氯仿法进行纯化。同时对pEGFPN1质粒行双酶切(EcoR I，Sal I)和纯化。将酶切回收的pp3501和pEGFPN1质粒进行连接。DNA重组质粒转化大肠埃希菌DH5а，筛选阳性克隆，提取质粒DNA，重组质粒测序鉴定送北京奥科生物工程公司测序。

1.4 MTT检测细胞生长曲线 HCC细胞(1.0×103)接种在96孔板培养板，连续培养5 d。每隔1 d取样，加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液。37℃培养4 h后，用100μL含20%SDS的50%二甲基酰胺溶液溶解细胞。用Varioskan Flash Reader spectrophotometer(THERMO，MA，USA)于570 nm 检测 A值［2-4］。

1.5 平板克隆形成实验 取对数生长期的肝癌细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备。按每孔100个细胞接种于6孔培养板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃、5%CO2及饱和湿度的环境下，静置培养2周。当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃上清液，用PBS浸洗2次。加纯甲醇或1∶3醋酸/甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加适量0.4%结晶紫应用染色液染10～30 min，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆或在显微镜(低倍镜)计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。

克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%

1.6 Western blot检测DAPK磷酸化变化 细胞用裂解缓冲液［50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，1%NP40，0.05%(PMSF)，2μg/mL aprotinin(Sigma，USA)，2μg/mL leupeptin(Sigma，USA)，pH 8.0)］处理。按前述方法进行 Western blot检测［5-6］，发光试剂用Amersham Biosciences公司产品。

1.7 统计学分析 数据采用SPSS17.0软件进行统计分析。定量检测结果用均数±标准差(±s)表示。方差齐性分析后用多重比较检测，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 pEGFPN1-pp3501重组表达质粒的PCR鉴定pp3501重组表达质粒经特异性引物的初步鉴定成功扩增出pp3501基因的开放阅读框片段，大小为432 bp，测序公司检测的序列是互补链，互补链的碱基序列见图1。测序结果经比对(GeneBank Accession:EU375738.1，GI:165 975 384;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU375 738.1)，与预期的pp3501开放阅读框序列完全一致，大小为432 bp，无移码突变，载体构建成功。

图1 pEGFPN1-pp3501重组质粒PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of pEGFPN1-pp3501 plasmid

2.2 pp3501抑制HCC细胞增殖 转染了pp3501的肝癌细胞生长曲线明显迟缓于对照组。克隆形成实验表明转染pp3501的肝癌细胞克隆数(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5 分别为 48.0%、40.3%、42.2%)较对照组细胞(91.8%、80.1%、80.5%)显著下降 ，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2、图3。

图2 pp3501对不同肝癌细胞生长的影响Figure 2 Effect of pp3501 on the growth of hepatocellular carcinoma cells

图3 pp3501抑制肝癌细胞克隆形成(n=4)Figure 3 Inhibitory clone formation of hepatocellular carcinoma cells(n=4)

2.3 pp3501对肝癌细胞表达死亡相关蛋白激酶(death-assocoated protein kinase，DAPK)的影响转染pp3501基因的细胞的DAPK磷酸化水平降低，总的DAPK水平不变，提示DAPK被激活。结果见图4-图6。

图4 pp3501对肝癌细胞DAPK表达水平的影响Figure 4 Effect of pp3501 on the DAPK expression levels in hepatocellular carcinoma cells

图5 灰度值分析DAPK磷酸化水平Figure 5 Gray value analysis of DAPK phosphorylation levels

图6 灰度值分析DAPK表达水平Figure 6 Gray value analysis of DAPK expression levels

3 讨 论

我们用限制性显示PCR技术分析丁酸钠处理Raji细胞前后基因表达变化时，发现其中一条来自19号染色体的表达序列与预测蛋白pp3501的基因序列相同［7］。根据我们的研究结果申请登录了该基因序列，Genbank登录号:EU375 738(GeneBank Accession:EU375 738.1，GI:165 975 384;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU375738.1)。

pp3501基因的开放阅码框有432 bp，编码的蛋白质由143氨基酸残基组成。ProtParam软件分析显示pp3501蛋白的理论相对分子质量为15739.7，理论等电点为11.60，是碱性蛋白。用Hopfield神经网络预测蛋白质二级结构，提示pp3501蛋白具有3个螺旋区域和6个 β折叠区域，无跨膜结构。ProtScale程序分析给出pp3501蛋白疏水区域最大值是1.489，位于90～100氨基酸残基区域，最小值为-2.911，提示pp3501应是亲水性蛋白。

NetPhos 2.0 Server软件分析pp3501蛋白序列提示，第11、87、129位丝氨酸残基和第41、135位苏氨酸残基是潜在的被丝氨酸/苏氨酸激酶磷酸化位点。NetPhosK 1.0软件分析进一步提示pp3501是多种蛋白激酶潜在的磷酸化底物。其中11位丝氨酸残基是潜在的p38MAPK、周期素依赖性蛋白激酶5、糖原合酶激酶3磷酸化位点;24、117位苏氨酸残基和68、107、129位丝氨酸残基是潜在的蛋白激酶C磷酸化位点;此外，68位丝氨酸残基也是潜在的DNA依赖的蛋白激酶磷酸化位点;129位丝氨酸残基也是潜在的蛋白激酶A磷酸化位点;41位苏氨酸残基是潜在的蛋白激酶G磷酸化位点。87位丝氨酸残基和135位苏氨酸残基是潜在的Ca2+/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位点。生物信息学预测pp3501具有多个蛋白激酶的磷酸化位点，提示pp3501可能具有不同的生物学功能，这均需要进一步实验验证。过表达pp3501的肝癌细胞生长曲线明显迟缓于对照组。相应的肝癌细胞克隆数比对照组细胞显著下降。这提示，pp3501能抑制肝癌细胞增殖，并同时观察到DAPK磷酸化水平下降。DAPK磷酸化降低意味DAPK活性增强［8］。

以往的研究证实，DAPK的表达水平变化与肿瘤的发生发展、肿瘤转移密切相关［9-11］。这提示转染pp3501的肝癌细胞，虽然不影响DAPK表达水平，但激活DAPK抑制肝癌细胞增殖。

DAPK是由Kimchi等发现的凋亡促进因子［12-13］。DAPK 转录成熟的 mRNA 为 5900 kb，编码蛋白相对分子质量为160 000。DAPK含多个功能区域，包括一个核心的催化区域，一个紧邻的钙调蛋白结合区域，一个由8个重复的锚定蛋白组成的区域［由33个氨基酸残基组成的重复序列，参与蛋白质与蛋白质之间的相互作用)、一个P-loops环(一种单核苷酸结合基序)、一个细胞骨架结合区域和一个死亡结构区域(DD区域)］。目前研究发现，DAPK可通过2种方式调控其活性。一种是钙调区域的自身磷酸化的自我抑制调节作用。磷酸化不仅调节酶的催化活性，也调节酶在体内的功能，这一点在细胞作用中是很关键的。另一种自身抑制机制与C末端的17个氨基酸残基有关，虽然目前对它活动的分子机制知之甚少，但它可能为特定药物的研发提供一个基础［14-16］。

过表达pp3501抑制肝癌细胞增殖同时能激活DAPK，但pp3501如何激活DAPK，其抑制肝癌细胞增殖是否依赖于DAPK激活尚待进一步实验证实。

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